華中農(nóng)業(yè)大學(xué)構(gòu)建玉米雌穗的空間轉(zhuǎn)錄組圖譜

　　近日，作物遺傳改良全國重點實驗室、湖北洪山實驗室楊寧教授、劉磊教授課題組聯(lián)合深圳華大研究院劉歡研究員課題組研究成果以“A spatial transcriptome map of the developing maize ear”為題在Nature Plants發(fā)表。研究構(gòu)建了首個玉米雌穗空間轉(zhuǎn)錄組圖譜，最終共獲得了12種細胞類型的轉(zhuǎn)錄組及其空間位置信息，鑒定并驗證了4種全新的細胞類型。利用空間組學(xué)的優(yōu)勢，鑒定到了兩個在小花分生組織頂端中特異性表達，并決定其分化確定性的MADS-box基因。通過整合單細胞轉(zhuǎn)錄組及空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，研究人員探索了一種高通量基因挖掘的新方法，通過構(gòu)建細胞特異性的基因共表達網(wǎng)絡(luò)鑒定了一批潛在控制玉米雌穗建成的新基因。

 

　　玉米作為我國主要糧食和飼料來源，其產(chǎn)量對農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)至關(guān)重要。提高玉米單位面積產(chǎn)量，特別是單穗粒數(shù)，是保障我國玉米供需平衡的關(guān)鍵。關(guān)鍵基因的時空特異性表達決定了玉米雌穗的發(fā)育，進而影響了玉米單穗產(chǎn)量。然而，常規(guī)的植物轉(zhuǎn)錄組技術(shù)往往忽略了細胞的異質(zhì)性，無法獲取關(guān)鍵基因的時空表達信息。另外，我們對于哪些細胞參類型與了玉米雌穗的形態(tài)建成仍然知之甚少。因此，當前以正向遺傳學(xué)手段挖掘調(diào)控雌穗發(fā)育的相關(guān)基因，并將其應(yīng)用于玉米穗部性狀改良中的效率相對較低。

 

　　研究人員首先優(yōu)化了Stereo-seq的實驗條件，開發(fā)了適用于玉米雌穗的空間轉(zhuǎn)錄組測序方法，并選取了處于關(guān)鍵生長發(fā)育期下的6mm雌穗作為實驗對象，對其分別進行空間轉(zhuǎn)錄組與單細胞轉(zhuǎn)錄組測序。在分析了空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)后，研究人員得到了12種細胞類型的轉(zhuǎn)錄組以及空間位置。參考已有研究中對玉米雌穗解剖學(xué)結(jié)構(gòu)的描述，可以快速定義細胞群身份。最終，研究人員發(fā)現(xiàn)大部分細胞類型都位于已知的雌穗發(fā)育器官內(nèi)，但同時也鑒定到了四種全新的細胞類型，包括三種分布在花序分生組織中的細胞和一種分布在小花分生組織中心的細胞。為了進一步驗證空間轉(zhuǎn)錄圖譜的可靠性，研究人員隨機選取了在空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中鑒定到的和已發(fā)表的具有空間表達特異性特征的標記基因（55個），利用原位雜交實驗驗證其表達模式。實驗結(jié)果表明，74%的基因在原位雜交中呈現(xiàn)的表達部位與空間轉(zhuǎn)錄組結(jié)果一致，說明了空間轉(zhuǎn)錄組測序的可行性和可靠性 。

 

　　基于Stereo-seq技術(shù)構(gòu)建的6mm雌穗的空間轉(zhuǎn)錄組圖譜能夠清楚區(qū)分不同類型的分生組織。因此，根據(jù)它們各自不同的空間位置，研究人員提取了6mm雌穗的花序分生組織以及小花分生組織轉(zhuǎn)錄組，并進行重聚類分析。結(jié)果表明，這些分生組織可以被進一步區(qū)分為三種不同的細胞類型，分別分布在花序分生組織頂端、小花分生組織外圍和小花分生組織頂端。通過檢測了在三種細胞類型之間存在的一系列差異表達基因，其中包括兩個MADS-box基因，ZmMADS8及其同源基因ZmMADS14，這兩個MADS-box基因在DMT中特異性表達，其表達模式通過mRNA原位雜交得到了驗證。先前的研究表明，MADS-box家族基因在植物器官發(fā)育中發(fā)揮了重要作用。因此，為驗證ZmMADS8與ZmMADS14的功能，研究人員通過CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)產(chǎn)生了ZmMADS8和ZmMADS14的雙基因敲除突變體。觀察發(fā)現(xiàn)，在ZmMADS8和ZmMADS14的單突變體中，小花分生組織均可發(fā)育正常，能夠產(chǎn)生正常的上位小花。而在CR-Zmmads8/14雙突變體中，小花分生組織不會向下一級花器官分化，而是會逆轉(zhuǎn)為不確定性長分枝，無法產(chǎn)生正常的花器官。這說明ZmMADS8和ZmMADS14是小花分生組織命運決定的關(guān)鍵因子。這些結(jié)果表明，基于Stereo-seq技術(shù)獲得的玉米雌穗空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)能夠區(qū)分高度相似的分生組織類型，使我們能夠進一步研究分生組織在分化過程中產(chǎn)生的細微變化，并有助于鑒定關(guān)鍵的發(fā)育調(diào)控因子。

 

　　接下來，研究人員利用STRIDE分析流程，將單細胞轉(zhuǎn)錄組與空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行了整合，通過空間映射，注釋了單細胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的6種細胞類型，并根據(jù)不同細胞的轉(zhuǎn)錄組信息構(gòu)建了具有空間表達特異性的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。其中，研究人員在玉米雌穗分生組織的表皮細胞中鑒定到了以O(shè)CL5（OUTER CELL LAYER 5）和OCL3（OUTER CELL LAYER 3）基因為hub節(jié)點的共表達網(wǎng)絡(luò)，這一共表達網(wǎng)絡(luò)中還包含另外三種類型的基因，分別為3-酮酯酰-CoA合成酶基因（3-ketoacyl-CoA synthase）以及表皮蠟質(zhì)合成基因（glossy genes）。OCL基因在形成籽粒表皮的角質(zhì)層中發(fā)揮重要作用的結(jié)論已經(jīng)在擬南芥以及玉米中被報道過，而在玉米雌穗的空間轉(zhuǎn)錄組圖譜中，OCL5基因明確表現(xiàn)出在雌穗分生組織的表皮細胞中特異表達的特征。因此，研究人員推測在該部位存在一個以O(shè)CL基因為核心的，與角質(zhì)層合成相關(guān)的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，而這一結(jié)論與分生組織表皮細胞所行使的生物學(xué)功能高度吻合。此外，研究人員還鑒定到了一個在花序分生組織中特異性表達的共表達網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)包含多個與海藻糖-6-磷酸合成相關(guān)的基因。而根據(jù)過去的研究，海藻糖-6-磷酸對于植物的生長發(fā)育非常重要。在該共表達網(wǎng)絡(luò)中，另一個NAC家族的轉(zhuǎn)錄因子NACTF25被鑒定為hub基因，并且在花序分生組織中特異性表達。因此，研究人員推測NACTF25可能通過調(diào)控與海藻糖-6-磷酸合成相關(guān)的基因表達來影響花序分生組織發(fā)育。

 

　　綜上所述，本研究通過結(jié)合關(guān)鍵發(fā)育時期下玉米雌穗的單細胞與空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，構(gòu)建了玉米雌穗的空間轉(zhuǎn)錄組圖譜。利用該圖譜能夠區(qū)分高度相似的分生組織類型，使我們能夠進一步研究分生組織在分化過程中產(chǎn)生的細微變化，并有助于鑒定關(guān)鍵的發(fā)育調(diào)控因子。圖譜中所有基因的表達模式（表達量與表達部位）以及在不同細胞類型中鑒定到的標記基因信息均可以通過https://db.cngb.org/stomics/mdesta/訪問查詢。

 

　　華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良全國重點實驗室和湖北洪山實驗室楊寧教授、劉磊教授及深圳華大研究院劉歡研究員為該論文共同通訊作者。華中農(nóng)業(yè)大學(xué)王躍斌博士、羅蕓博士、李云富博士、嚴佳麗和深圳華大研究院郭興博士為該論文的共同第一作者。華中農(nóng)業(yè)大學(xué)嚴建兵教授、張祖新教授，美國冷泉港實驗室David Jackson教授，深圳華大研究院徐訊研究員參與指導(dǎo)了該項工作。華中農(nóng)業(yè)大學(xué)卓琳、魏文杰、丁倩、柏民基，以及深圳華大研究院魏曉鋒、邵雯雯、陳麗華、黎麗、楊濤、陳靜為研究提供了技術(shù)支持。該工作得到了農(nóng)業(yè)生物育種重大項目、國家自然科學(xué)基金委優(yōu)秀青年科學(xué)基金、國家重點研發(fā)計劃等項目的資助。

 

　　【英文摘要】

 

　　A comprehensive understanding of inflorescence development is crucial for crop genetic improvement, as inflorescence meristems give rise to reproductive organs and determine grain yield. However, dissecting inflorescence development at the cellular level has been challenging owing to a lack of specific marker genes to distinguish among cell types, particularly in different types of meristems that are vital for organ formation. In this study, we used spatial enhanced resolution omics-sequencing （Stereo-seq） to construct a precise spatial transcriptome map of the developing maize ear primordium, identifying 12 cell types, including 4 newly defined cell types found mainly in the inflorescence meristem. By extracting the meristem components for detailed clustering, we identified three subtypes of meristem and validated two MADS-box genes that were specifically expressed at the apex of determinate meristems and involved in stem cell determinacy. Furthermore, by integrating single-cell RNA transcriptomes, we identified a series of spatially specific networks and hub genes that may provide new insights into the formation of different tissues. In summary, this study provides a valuable resource for research on cereal inflorescence development, offering new clues for yield improvement.

 

　　論文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41477-024-01683-2