近日，西南大學(xué)柑桔研究所質(zhì)檢中心焦必寧研究員團(tuán)隊(duì)在國(guó)際期刊Food Chemistry發(fā)表題為“CRISPRCas12a based fluorescence assay for organophosphorus pesticides in agricultural products”的研究論文（https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2022.132919）。我所碩士研究生付瑞杰為文章第一作者，焦必寧研究員和何悅教授為文章共同通訊作者。本研究得到國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目課題和現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（柑橘）產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系等項(xiàng)目資助。
在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，有機(jī)磷農(nóng)藥被廣泛用于防治植物病蟲(chóng)草害，對(duì)農(nóng)業(yè)增產(chǎn)有益。但不恰當(dāng)?shù)氖褂脮?huì)對(duì)環(huán)境造成污染，對(duì)人和動(dòng)物造成危害。有機(jī)磷農(nóng)藥屬于一種神經(jīng)毒物，可對(duì)人和動(dòng)物體內(nèi)中樞神經(jīng)的乙酰膽堿酯酶（AChE）活性產(chǎn)生不可逆的抑制作用，從而引起神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿的累積，造成神經(jīng)功能的紊亂。因此，對(duì)農(nóng)產(chǎn)品中的有機(jī)磷農(nóng)藥殘留進(jìn)行快速、靈敏、準(zhǔn)確的檢測(cè)，對(duì)維護(hù)食品安全和農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。
近期，作為新一代基因編輯技術(shù)的CRISPR-Cas12a在核酸診斷領(lǐng)域展現(xiàn)出了巨大的應(yīng)用前景。Cas12a 蛋白在同源CrRNA 識(shí)別靶標(biāo)DNA 之后，不僅能特異性地切割靶標(biāo)DNA，還可非特異性地切割周?chē)魏螁捂淒NA（ssDNA）。CRISPR-Cas12a系統(tǒng)具有具有精準(zhǔn)切割、價(jià)格低廉、功能強(qiáng)大、便于操作等顯著優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已被科學(xué)家創(chuàng)新性地引入到核酸快速檢測(cè)領(lǐng)域，成為現(xiàn)有核酸診斷技術(shù)的巨大突破。得益于CRISPR-Cas12a高效的酶切活性，加之與各種DNA 擴(kuò)增技術(shù)相結(jié)合，使得CRISPR-Cas12a 系統(tǒng)對(duì)DNA 的檢測(cè)靈敏度低至aM水平。然而，將CRISPR-Cas12a應(yīng)用于有機(jī)磷農(nóng)藥殘留檢測(cè)還未見(jiàn)報(bào)道。
為了實(shí)現(xiàn)這個(gè)目標(biāo)，該工作創(chuàng)新性地將對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥的特異性識(shí)別事件轉(zhuǎn)化為對(duì)CRISPR-Cas12a的酶切活性調(diào)控事件，提出了一種基于雙酶級(jí)聯(lián)催化調(diào)控CRISPR-Cas12a 酶切活性的熒光檢測(cè)新方法，實(shí)現(xiàn)了有機(jī)磷農(nóng)藥的靈敏檢測(cè)。在最優(yōu)條件下，該方法對(duì)對(duì)氧磷、敵敵畏和內(nèi)吸磷的檢出限分別為270、406 和218 pg/mL。在柑橘類(lèi)水果和卷心菜樣品中三個(gè)加標(biāo)濃度水平下，其平均回收率為96.43~100.85%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 （RSD, n=3） 低于5.6%。在該工作中，MnO2納米片及Mn2+依賴(lài)的DNAzyme成為了銜接有機(jī)磷農(nóng)藥特異性識(shí)別與CRISPR-Cas12a酶切活性的橋梁，首次實(shí)現(xiàn)了CRISPR-Cas12a在農(nóng)藥殘留檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用。得益于MnO2納米片優(yōu)異的物理性能和三輪酶促信號(hào)放大策略的有機(jī)結(jié)合，該方法在農(nóng)產(chǎn)品中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留檢測(cè)領(lǐng)域呈現(xiàn)出較好的應(yīng)用潛力。
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