2022年1月18日，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院/農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點實驗室微生物光合作用與生物固氮團隊端木德強教授課題組在國際學(xué)術(shù)期刊Plant Biotechnology Journal在線發(fā)表了題為“Single cell-type transcriptome profiling reveals genes that promote nitrogen fixation in the infected and uninfected cells of legume nodules”的研究論文，利用單細胞測序方法鑒定到豆科植物固氮根瘤中侵染細胞和非侵染細胞之間的差異表達基因網(wǎng)絡(luò)，拓寬了對根瘤固氮系統(tǒng)中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、代謝途徑及轉(zhuǎn)運途徑的理解。

 

　　氮肥的使用對于提高作物產(chǎn)量至關(guān)重要。然而，氮肥的過度使用造成能源耗費和嚴(yán)重的環(huán)境污染問題，因此生物固氮的研究和利用就顯得尤為重要。生物固氮分為共生固氮、自生固氮和聯(lián)合固氮，豆科植物與根瘤菌形成的共生固氮系統(tǒng)是最為高效的生物固氮的方式，植物光合作用的產(chǎn)物作為碳源提供給根瘤利用，而根瘤固定的氮素轉(zhuǎn)運到地上組織（圖1）。在百脈根、大豆、苜蓿等模式豆科植物中，研究人員對根瘤固氮的機制進行了廣泛的研究。在過去的二十年中，大多數(shù)研究集中在根瘤共生的早期階段。然而，對于在成熟根瘤中調(diào)控固氮的分子機制知之甚少。本研究利用百脈根作為研究對象，通過分離成熟根瘤中的侵染細胞 （IC） 和非侵染細胞 （UC）并進行單細胞測序分析，挖掘根瘤中調(diào)控高效固氮的關(guān)鍵基因，解析其參與的細胞調(diào)控過程。

 

　　該研究首先通過顯微操作獲得了百脈根成熟根瘤中的兩種細胞組分：紅棕色的侵染細胞和透明的非侵染細胞（每種類型的細胞分離50~100個）；通過微量RNA提取、Smart-Seq2建庫和測序，最終鑒定到939個差異表達基因，其中有925個基因為本研究中新鑒定發(fā)現(xiàn)，包括55個轉(zhuǎn)錄因子和73個轉(zhuǎn)運蛋白（圖2）。已報道的共生固氮相關(guān)的基因如豆血紅蛋白基因（LjLbs）和硫酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因（LjSST1）在侵染細胞中高水平表達；相反，氨轉(zhuǎn)運蛋白（LjAMT1.1）和ERF轉(zhuǎn)錄因子（LjERF1）僅在非侵染細胞中表達。該研究發(fā)現(xiàn)六個蔗糖合成酶基因中的兩個基因和七個轉(zhuǎn)化酶基因中的一個基因在非侵染細胞中表達水平較高，這些結(jié)果支持蔗糖被運輸?shù)椒乔秩炯毎⒎纸鉃槎人猁}的模型。谷氨酰胺合成酶（GS）和天冬酰胺合成酶（AS）是氨同化為谷氨酰胺和天冬酰胺的兩種關(guān)鍵酶，該研究發(fā)現(xiàn)編碼GS的五個基因中的兩個基因在根瘤的侵染細胞和非侵染細胞中均高度表達；氨轉(zhuǎn)運蛋白（LjAMT1.1）在非侵染細胞中特異表達，表明非侵染細胞可能有助于氨的同化。此外，六個 AS 基因中的兩個在非侵染細胞中的表達顯著高于侵染細胞，表明谷氨酰胺可能在侵染細胞和非侵染細胞中都有效合成。

 

　　根瘤中豆血紅蛋白通過其輔因子血紅素與氧氣結(jié)合與解離，從而實現(xiàn)根瘤中微氧環(huán)境的精細調(diào)控。血紅素在質(zhì)體中通過四吡咯途徑合成，其中谷氨酰-tRNA還原酶（GluTR）催化血紅素生物合成的限速步驟。百脈根基因組編碼三個GluTR基因，轉(zhuǎn)錄組結(jié)果表明LjGluTR2只在侵染細胞中表達。啟動子-GUS融合分析發(fā)現(xiàn)侵染細胞中LjGluTR2的表達顯著增強。FLU蛋白 （Fluorescence in blue light） 通過抑制GluTR活性負反饋調(diào)節(jié)四吡咯途徑，利用在侵染細胞中表達的LjLb2啟動子過表達FLU基因，與對照植物相比過表達FLU的植物莖鮮重減少，紅色根瘤減少，且形成了更多白色根瘤，根瘤中的血紅素水平下降。這些結(jié)果表明，血紅素生物合成的翻譯后調(diào)控對成熟根瘤的高效固氮至關(guān)重要（圖3）。

 

　　綜上，該研究系統(tǒng)鑒定了在固氮根瘤中侵染細胞和非侵染細胞中的差異表達基因。這些基因大部分為本研究首次鑒定發(fā)現(xiàn)，為進一步深入研究根瘤內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、代謝通路和代謝物在根瘤中的轉(zhuǎn)運來實現(xiàn)對共生固氮的協(xié)同調(diào)控的分子機制奠定了基礎(chǔ)。

 

　　博士后王龍龍和博士研究生周宇并列為本文的第一作者，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院、農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點實驗室端木德強教授為通訊作者。本研究得到了國家自然科學(xué)基金、中國博士后科學(xué)基金、中央高?；究蒲袑ｍ椯Y金以及生科院博士后百川計劃的支持。

 

　　【英文摘要】

 

　　Symbiotic nitrogen fixation （SNF） is an efficient and environmentally friendly biological nitrogen-fixing system. The mechanism of SNF has been extensively studied in root nodules. Over the past two decades, most studies focused on the early stages of root nodule symbiosis. However, little is known about mechanisms in maintaining an efficient SNF in mature nodules. In this study, we separated two main types of cells in mature nodules, known as infected cells （ICs） and uninfected cells （UCs）。 Using Smart-Seq2 single-cell RNA sequencing approach, hundreds of genes were found to be significantly differentially expressed between ICs and UCs. Notably, most of them were uncharacterized previously, including many transcription factors and putative transporters. Specific isoforms of genes encoding key enzymes involved in sucrose metabolism and ammonia assimilation were identified. Our results confirm that asparagine, one of the nodule exported nitrogen componds, is mainly synthesized in UCs. In contrast, glutamine might be actively synthesized in both ICs and UCs. Leghemoglobins are the most abundant proteins in nodules and heme is an essential prosthetic group of Lbs. Our study identified distinctive expression patterns of three glutamyl-tRNA reductase （GluTR） genes encoding the key enzyme catalyzing the rate-limiting step of heme synthesis. We additionally overexpressed the GluTR feedback inhibitor protein, FLU （Fluorescence in blue light） in ICs, and observed a dramatically reduced heme content and a SNF deficiency phenotype, indicating that posttranslational regulation of heme biosynthesis is essential for nodule functioning. Our study therefore provides a valuable resource for investigating specific genetic components responsible for the complex cellular processes between ICs and UCs in mature nodules. It also lays the foundation for improving the SNF efficiency in legumes in the future and even ultimately being engineered into non-legume crops.

 

　　原文鏈接：

 

　　https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.13778