實現(xiàn)重要農(nóng)作物精準基因組編輯對加快農(nóng)作物遺傳改良進程具有重要意義。引導編輯技術（Prime editing）是一種基于CRISPR/Cas系統(tǒng)的全新精確基因組編輯技術。2020年，包括我院在內(nèi)的多家實驗室實現(xiàn)了植物引導編輯技術的初步突破，但植物基因組中很多位點編輯效率依舊很低，亟需突破技術瓶頸，實現(xiàn)編輯效率顯著提升。

 

　　近日，北京市農(nóng)林科學院玉米DNA指紋及分子育種北京市重點實驗室基因組編輯團隊與北京大學等單位合作，發(fā)現(xiàn)新策略協(xié)同效應，在植物引導編輯技術研發(fā)方面取得了重大新突破，實現(xiàn)了玉米和水稻引導編輯效率平均可提高3倍，在多個低效靶點上甚至可提高10倍以上，并在人細胞中進行了驗證。該結果于12月23日以“A design optimized prime editor with expanded scope forbid capability in plants”為題在植物科學類國際頂級學術刊物Nature Plants（15.793）在線發(fā)表。

 

　　該團隊在前期研究中發(fā)現(xiàn)，在ALS基因靶點的反轉(zhuǎn)錄（reverse tranase，RT）模板中引入2個額外的同義錯配堿基，可使其編輯效率增加7倍。繼續(xù)使用類似策略在水稻愈傷8個靶點上進一步測試，發(fā)現(xiàn)半數(shù)靶點在模板引入同義錯配堿基時編輯效率明顯提高，這在人細胞實驗中也得到了驗證；植物引導編輯普遍沿用Cas9切刻酶變體H840A的C端融合逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV的方式，本研究發(fā)現(xiàn)N端融合的編輯效率在植物3個I型靶點上明顯高于C端融合的，而在II型靶點和人細胞中的編輯效率均無明顯差異。穩(wěn)定轉(zhuǎn)化結果表明，在測試的8個靶點上，引入同義錯配堿基和N端融合均不同程度地提高了編輯效率。進一步研究發(fā)現(xiàn)，將“引入同義錯配堿基”與“N端融合”這兩種策略組合（PE-P3-RT-M）使用時，出現(xiàn)了倍增協(xié)同效應。在愈傷中的5個靶點上增效倍數(shù)平均達到10倍以上。而在穩(wěn)定轉(zhuǎn)化材料的8個靶點上，編輯效率平均提升也在10倍以上，尤其在4個原來不能編輯的靶點上，實現(xiàn)了平均約25%的編輯效率。為進一步確認該組合策略的倍增協(xié)同效果，作者在水稻和玉米各選擇了另外7個基因組靶點進行了測試，結果發(fā)現(xiàn)，在大多數(shù)靶點中，PE-P3-RT-M策略均表現(xiàn)出最高的協(xié)同增效。作者最后還總結了測試靶點的特征形式，并對植物中進行引導編輯高效靶點設計給出了詳細建議。

　　最近，哈佛大學David Liu團隊在Cell雜志上報道，通過瞬時表達抑制DNA錯配修復（MMR）通路的蛋白，或在模板上引入沉默堿基，提高引導編輯效率2.0到7.7倍。與上述研究相比，本研究不僅首次發(fā)現(xiàn)引入同義錯配堿基可以顯著提升植物引導編輯的效率，并發(fā)現(xiàn)了N端融合逆轉(zhuǎn)錄酶比C端融合更有利于植物的逆轉(zhuǎn)錄過程。而將“引入同義錯配堿基”與“N端融合”策略組合在一起時，還具有倍增協(xié)同效應，可獲得更高的植物引導編輯效率。這三方面全新發(fā)現(xiàn)實現(xiàn)了基因組編輯技術的新突破，大幅提升了引導編輯效率，為植物基因組功能解析和作物精準育種提供了強有力的技術支撐。

 

　　徐雯、楊永星為本文共同第一作者，楊進孝和趙久然研究員為通訊作者，北京大學張博、張傳茂教授團隊、西南大學肖前林副教授團隊參與了本項工作。本研究得到北京學者（BSP041）、院財政專項基金的支持。玉米基因組編輯團隊是2017年由玉米DNA指紋及分子育種重點實驗室引進建設的技術創(chuàng)新團隊，目前團隊主要聚焦于堿基編輯、精確替換、組學編輯及其在玉米和水稻等作物中的高效應用。這是該團隊自引進以來在國際學術期刊上發(fā)表的第10篇高水平研究論文。

 

　　原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41477-021-01043-4