微生物組學(xué)在葡萄枝干病害防治中的研究進(jìn)展

　　葡萄（Vitis vinifera L.）是世界四大水果之一，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。我國(guó)葡萄種植面積為79.79萬(wàn)hm2，居世界第二，產(chǎn)量高達(dá)1349萬(wàn)t，居世界首位（聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織2018年數(shù)據(jù)）。在全球葡萄產(chǎn)業(yè)高速發(fā)展的同時(shí)，葡萄病害問(wèn)題日益嚴(yán)重，其中葡萄枝干病害被認(rèn)為是過(guò)去30年來(lái)最具破壞性的葡萄病害，危害嚴(yán)重。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球葡萄種植區(qū)每年更換因枝干病害導(dǎo)致的壞死葡萄樹消耗超過(guò)15億美元，美國(guó)加州葡萄年產(chǎn)值約為230億美元，但因枝干病害造成的損失超過(guò)2.6億美元。由于目前沒(méi)有高效穩(wěn)定的殺菌劑、抗病品種缺乏、農(nóng)業(yè)防治成本過(guò)高，葡萄枝干病害亟需開發(fā)新的防治手段。

 

 

　　葡萄枝干病害是一類真菌性病害，主要包括葡萄衰枯病（ESCA）、葡萄潰瘍?。˙otryosphaeria Dieback）、葡萄頂枯?。‥utypa dieback）、葡萄蔓枯?。―iaporthe dieback）和葡萄黑根?。˙lack Foot Disease）等5類，其病原十分復(fù)雜，主要包括Botryosphaeriaceae、Phaeomoniellaceae、Togniniaceae、Diaporthaceae等9個(gè)科中32個(gè)屬（如Botryosphaeria、Phaeoacremonium、Eutypa、Diatrype）的真菌，如葡萄座腔菌科（Botryosphaeriaceae）中已知引起葡萄潰瘍病的真菌包括Botryosphaeria、Diplpdia、Neofusicoccum、Lasiodiplodia等9個(gè)屬35個(gè)物種，并且在不同的地域、氣候環(huán)境中導(dǎo)致同一類枝干病害發(fā)生的病原菌會(huì)有所差異。在自然條件下，病原菌主要通過(guò)植物的氣孔、傷口等侵入葡萄，定殖在多年生的木質(zhì)化枝干中，在適合條件下導(dǎo)致維管束病變，在枝干中央部分產(chǎn)生褐色條紋或者由潰爛導(dǎo)致枝干變色、壞死，多數(shù)情況下還會(huì)引起葉片的黃化、壞死和變形等，最終導(dǎo)致葡萄在短期或長(zhǎng)期內(nèi)死亡。

 

　　葡萄枝干病害最重要的發(fā)生特點(diǎn)是機(jī)會(huì)性發(fā)病，即病原菌以內(nèi)生性的方式在健康樹體中長(zhǎng)期潛伏，當(dāng)遇到極端環(huán)境或樹體健康不良的情況，其生活方式可由內(nèi)生性轉(zhuǎn)變?yōu)橹虏⌒?，從而?dǎo)致枝干、葉部和果實(shí)發(fā)病，并且存在第N年發(fā)病、N+1年不發(fā)病、N+2年是否發(fā)病不可預(yù)測(cè)的情況，這種機(jī)會(huì)性發(fā)病特點(diǎn)與其所處的環(huán)境以及樹體的健康狀態(tài)息息相關(guān)。

 

 

　　植物的各個(gè)器官組織及其賴以生存的根系土壤中定殖著多種微生物，它們與植物之間存在多種作用方式，從共生到致病，這種相互作用對(duì)植物生產(chǎn)力、健康和微生態(tài)等起著關(guān)鍵的作用。其中益生菌可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)生態(tài)位、抗生作用、誘導(dǎo)抗性等抑制病原菌的生長(zhǎng)繁殖或直接殺滅病原菌，也可附著在植物表面形成防御層，提高植物免疫力，從而產(chǎn)生防病促生作用。

 

　　由于葡萄枝干病害具有受環(huán)境及自身免疫力影響較大的機(jī)會(huì)性發(fā)病的“慢性病”特征，因此科研人員通過(guò)篩選并外源添加益生菌，調(diào)節(jié)植物微生態(tài)，以提高植物自身免疫力或直接抑制病原菌，以期實(shí)現(xiàn)對(duì)葡萄枝干病害的防治。截至目前，已有50余種不同來(lái)源的微生物菌株對(duì)葡萄枝干病害的生物防治效果被研究，如木霉菌（Trichoderma）、粉紅螺旋聚孢霉（Clonostachys rosea）、假單胞菌MP12（Pseudomonas sp. MP12）、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens），其中木霉菌（Trichoderma）的使用頻率最高，也只有木霉屬（Trichoderma spp.）的菌株被開發(fā)成產(chǎn)品，如哈茨木霉（T. harzianum）T39、AG1，但其發(fā)揮功能的前提是成功并長(zhǎng)期定殖在葡萄枝干內(nèi)，具體防效受到施用方法、葡萄品種、氣候條件以及枝干病害的種類等因素的限制。Patricia等發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）PTA-271可增強(qiáng)葡萄的免疫反應(yīng)，并使參與植物解毒過(guò)程的酶PAL（苯丙氨酸解氨酶）、STS（芪合酶）及GST1（編碼谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶）顯著表達(dá)，增強(qiáng)解毒作用，有效防治潰瘍病，但其防效具有溫度依賴性，僅在28℃左右有效，在實(shí)際生產(chǎn)中很難控制；Yacoub等發(fā)現(xiàn)生防菌寡雄腐霉（Pythium oligandrum）的接種能使多個(gè)涉及葡萄防御的基因的表達(dá)水平顯著增加或降低，強(qiáng)烈地刺激葡萄的防御反應(yīng)，加強(qiáng)對(duì)衰枯病病原菌Phaeomoniella chlamydospora的攻擊，當(dāng)接種在扦插苗根部時(shí)可減少壞死40%~50%，但必須保證生防菌能成功接種并定殖在扦插苗上，其防效受其定殖情況的影響。

 

　　由此可見，使用單一生防菌株來(lái)防治葡萄枝干病害的防效不穩(wěn)定，且進(jìn)行菌株的純培養(yǎng)、篩選和制劑等過(guò)程所消耗的成本較高，不是最高效的防控手段。

 

 

　　微生物組是指包括微生物和其基因組以及其周圍環(huán)境在內(nèi)的全部。近年來(lái)，微生物組研究已經(jīng)取得巨大進(jìn)展，并在一些領(lǐng)域取得了顯著的效益，特別是在作物微生物組領(lǐng)域，科研人員利用微生物組-植物-植物病害的相互作用關(guān)系，在了解微生物組的結(jié)構(gòu)與功能的基礎(chǔ)上，挖掘和建立核心益生微生物組或功能菌群，從微生態(tài)角度來(lái)防治植物病害，提高作物產(chǎn)量。

 

　　在自然條件下，植物的抗病能力與植物微生物組的組成和功能息息相關(guān)。研究表明，有益微生物組有多種抗菌防病的作用機(jī)制：產(chǎn)生抗菌物質(zhì)或通過(guò)重寄生、生態(tài)位競(jìng)爭(zhēng)，尤其是通過(guò)調(diào)整真菌-細(xì)菌間的平衡等作用直接抑制病原菌的增殖；通過(guò)誘導(dǎo)寄主抗性或微生物生防菌活性間接抑制病原菌的致病性；改變植物的生理狀態(tài)等以刺激植物的免疫系統(tǒng)，間接提高其對(duì)病原體的抵抗力，使免疫系統(tǒng)更有效地對(duì)抗致病菌；轉(zhuǎn)化環(huán)境中所存在的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，提高植物生長(zhǎng)所需要的營(yíng)養(yǎng)水平，并促進(jìn)其對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，產(chǎn)生直接促生作用。核心微生物組是指在自然條件下對(duì)植物發(fā)揮特異性抗逆作用的微生物集合，即可穩(wěn)定、高效遺傳且維持自然微生物群體功能的最小子集。因此，相較于單純依賴培養(yǎng)和篩選生防菌，基于微生物群落結(jié)構(gòu)分析及微生物培養(yǎng)構(gòu)建核心微生物組則可以獲得更多的益生菌資源。前者由于生防菌株單一而導(dǎo)致防控效果不穩(wěn)定；后者所構(gòu)建的核心微生物組則能夠在促進(jìn)植物生長(zhǎng)、增產(chǎn)和抗病等方面發(fā)揮更加持久高效的作用，并已在多種植物中得以應(yīng)用。冀宇等利用3種功能菌株淡紫擬青霉（Purpureocillium lilacinum）YES-2、紅灰鏈霉菌（Streptomyces rubrogriseus）HDZ-9-47和植物根際促生菌蒼白桿菌（Ochrobactrum spp.）NC1人工構(gòu)建并研制出一種防控黃瓜根結(jié)線蟲的功能型復(fù)合微生物菌劑，該菌劑高效、增產(chǎn)且環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)，在田間對(duì)移栽后38d和105d病株防效達(dá)56.5%和42.5%，并使黃瓜增產(chǎn)10.7%，株產(chǎn)量達(dá)2.375kg；諾維信旗下公司通過(guò)對(duì)植物根系微生物組的規(guī)模化分析將成功分離、培養(yǎng)出的解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）和綠木霉菌（T. virens）進(jìn)行配比和成分優(yōu)化，研制出田間增產(chǎn)效果優(yōu)良且穩(wěn)定的種子包衣劑，可使小麥每公頃增產(chǎn)220~250kg。

 

　　目前，葡萄微生物組的研究已經(jīng)取得了一些進(jìn)展。植物和微生物可相互影響，研究表明，多種因素可以影響葡萄微生物組，包括砧木基因型、大氣等，而葡萄微生物組可能與其病害的發(fā)生息息相關(guān)。

 

　　Deyett等利用微生物組分析挖掘出患皮爾斯病（Pierce's disease）的葡萄藤汁液的核心微生物群，包括鏈球菌（Streptococcus）、擬桿菌（Bacteroides）等7類細(xì)菌以及枝孢屬（Cladosporium）、球腔菌屬（Mycosphaerella）等5類真菌，它們?cè)谡麄€(gè)物候期均存在，并在患中度皮爾斯病的葡萄中富集，且中度皮爾斯癥狀的葡萄比健康或嚴(yán)重癥狀的葡萄顯示出更高的微生物多樣性，這表明葡萄可以通過(guò)調(diào)動(dòng)和調(diào)節(jié)微生物組來(lái)抵抗病原體的攻擊或參與某種關(guān)鍵的生理反應(yīng)，以增強(qiáng)抗病力和適應(yīng)能力，達(dá)到抗病的目的。同時(shí)研究者還從中確定了幾種與抗病、促生相關(guān)的細(xì)菌和真菌靶標(biāo)，如假單胞菌屬（Pseudomonas）、寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas）等。Asghari等發(fā)現(xiàn)與使用單一內(nèi)生細(xì)菌防治葡萄冠癭病相比，同時(shí)使用假單胞桿菌（Pseudomonas sp.）Sn48和泛菌（Pantoea sp.）Sa14可使植物抗毒素和病程相關(guān)蛋白防御基因的表達(dá)顯著增加并產(chǎn)生誘導(dǎo)抗性，大量研究也表明拮抗內(nèi)生細(xì)菌群［包括枯草芽孢桿菌（B. Subtilis）EN631、芽孢桿菌（Bacillus sp.）EN71-1等］對(duì)冠癭病的防控更加高效、穩(wěn)定。

 

　　此外，研究表明微生物組可能與葡萄枝干病害的發(fā)生相關(guān)。Nerva等利用微生物組分析比較了有、無(wú)葡萄衰枯?。‥sca）癥狀的葡萄根圍土壤微生物群落組成，發(fā)現(xiàn)其細(xì)菌和真菌群落相對(duì)豐度沒(méi)有顯著差異，但衰枯病病原體和其他枝干病病原體在有病害癥狀土壤中更為豐富，如Neofusicoccum和Phaeoacremonium是最豐富的真菌屬，且Phaeoacremonium和Phaeomoniella屬在有病害癥狀的土壤中富集，此外，芽孢桿菌屬（Bacillus）和鏈霉菌（Streptomyces）分別在有、無(wú)病害癥狀土壤中富集，推測(cè)它們可能是潛在的抗病菌種。Del Frari等對(duì)發(fā)生衰枯病的葡萄枝干不同位置進(jìn)行ITS區(qū)域擴(kuò)增測(cè)序和群落結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果顯示，在有、無(wú)“虎紋斑”葉片的枝干中真菌群落結(jié)構(gòu)沒(méi)有明顯差異，前者中白腐病原菌嗜藍(lán)孢孔菌（Fomitiporia sp.）是優(yōu)勢(shì)種群，而在后者中與衰枯病相關(guān)真菌P. chlamydospora是優(yōu)勢(shì)種群，這些結(jié)果表明葡萄枝干真菌群落不受其葉片“虎紋斑”癥狀影響，反之亦然，由枝干病害病原菌引起的維管束病變可能是導(dǎo)致其“虎紋斑”葉片的原因。Niem等基于同一葡萄園中有、無(wú)枝干病害癥狀（潰瘍）樹體枝干內(nèi)生真菌、細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)相較于有癥狀樹體，Pseudomonas spp.在無(wú)癥狀樹體中的相對(duì)含量為56%~74%，顯著高于有癥狀樹體（2%~29%）。對(duì)分離培養(yǎng)所得到的熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）與已知GTDs病原菌（葡萄潰瘍病菌、葡萄頂枯病菌和葡萄衰枯病菌）進(jìn)行對(duì)峙培養(yǎng)試驗(yàn)，獲得了10株具有拮抗活性的菌株，說(shuō)明這些菌株具有作為生防菌用于防治GTDs的潛力。

 

　　此外，對(duì)葡萄整個(gè)樹體的微生物組研究表明，葡萄地下部分的微生物群落多樣性比地上部分更加豐富，它們可通過(guò)根組織向地上部分運(yùn)輸，其中土壤是主要源庫(kù)，同時(shí)，葡萄根際富集的鏈霉菌（Streptomyces spp.）、假單胞菌（Pseudomonas spp.）和根瘤菌（Rhizobia）是參與其磷和氮代謝最活躍的細(xì)菌。這表明地下部分的益生菌群具有達(dá)到地上部分發(fā)揮抗病功效的潛力，葡萄地下部分微生物組對(duì)葡萄的生長(zhǎng)與健康至關(guān)重要。這些結(jié)果表明土壤可作為生防菌的“儲(chǔ)存庫(kù)”，建立抑菌菌群，這有可能成為一種潛在的有效抑制枝干病害替代方案。

 

　　因此，通過(guò)微生物組學(xué)分析界定、分離葡萄的核心益生微生物組可為防治葡萄病害提供新的理論基礎(chǔ)和菌種資源。雖然目前通過(guò)微生物組學(xué)來(lái)獲得核心益生微生物組，以成功防治葡萄枝干病害的研究還未見報(bào)道，但利用微生物組學(xué)來(lái)防治枝干病害是非常有希望的途徑。

 

 

　　通過(guò)微生物組學(xué)研究方法明確與葡萄枝干病害發(fā)生相關(guān)的微生物群落結(jié)構(gòu)和功能特征是實(shí)現(xiàn)其應(yīng)用的前提。微生物群落的基本結(jié)構(gòu)和特征是該群落中微生物的物種分類與豐度、基因功能特征及不同微生物間的相互作用。目前描述微生物群落的物種豐度主要有2類方法，即相對(duì)定量和絕對(duì)定量，毫無(wú)疑問(wèn)，絕對(duì)定量對(duì)微生物群落的描述更加準(zhǔn)確，但因其操作繁瑣，對(duì)植物內(nèi)生菌的引物特異性差，目前對(duì)微生物群落研究主要使用相對(duì)定量法。

 

　　相對(duì)定量法是指提取樣品總DNA后，利用二代或者三代測(cè)序技術(shù)對(duì)基因擴(kuò)增子、宏基因組或宏轉(zhuǎn)錄組樣本進(jìn)行測(cè)序，序列經(jīng)過(guò)物種注釋后，依據(jù)每個(gè)物種的序列多少來(lái)進(jìn)行物種豐度的描述，單個(gè)樣本中物種豐度是指不同物種OTU序列占全部序列的比例，但當(dāng)比較2個(gè)及以上樣本的物種結(jié)構(gòu)差異時(shí)，由于不同樣本的微生物總量是不同的，這種相對(duì)豐度比較可能造成失真的現(xiàn)象，掩蓋了樣本的真實(shí)群落結(jié)構(gòu)。

 

　　目前微生物組的絕對(duì)定量方法主要有2種。一種是向樣本中添加內(nèi)參以確定樣本微生物總量。首先選擇合適的DNA片段作為內(nèi)參基因的主要序列，選擇的原則是內(nèi)參序列與擴(kuò)增目標(biāo)序列的長(zhǎng)度及GC含量相似，該序列可以由隨機(jī)DNA片段生成器生成（https://www.faculty.ucr.edu），并于其序列兩端連接測(cè)序所用引物，如16S rRNA、18S rRNA及ITS等基因序列片段擴(kuò)增所用的引物。由于土壤對(duì)裸露DNA片段以及細(xì)菌本身的吸附性不一致，所以一般將該片段連接在載體并克隆到大腸桿菌的感受態(tài)細(xì)胞中后，再添加到樣品中，而不是直接將裸露的DNA片段添加到樣品中。最后按照比例定量添加到土壤樣品中，混合樣本按照常規(guī)樣品進(jìn)行DNA提取、片段擴(kuò)增及測(cè)序，根據(jù)測(cè)序結(jié)果中內(nèi)參的序列相對(duì)豐度及實(shí)際添加量來(lái)對(duì)其他物種進(jìn)行定量。第2種方法：利用qPCR技術(shù)通過(guò)高通量測(cè)序的引物對(duì)樣本中的微生物（細(xì)菌或真菌）絕對(duì)總量進(jìn)行定量，然后再根據(jù)測(cè)序數(shù)據(jù)得到的相對(duì)含量確定不同分類水平物種的絕對(duì)含量。以上2種方法僅適用于土壤等環(huán)境樣本，當(dāng)檢測(cè)植物內(nèi)生樣本時(shí)，由于植物中質(zhì)體的DNA中具有保守的16S rDNA及ITS序列，測(cè)序結(jié)果中難以區(qū)分?jǐn)?shù)據(jù)來(lái)源于微生物或植物本身。針對(duì)這一問(wèn)題，Guo等開發(fā)了宿主相關(guān)絕對(duì)定量分析方法（Host-associated quantitative abundance profiling, HA-QAP），該方法將植物特異基因（如水稻開花調(diào)節(jié)基因RID1）作為內(nèi)參的主要序列，在兩端連接16S rRNA及ITS通用引物，形成內(nèi)參DNA片段，并將之按比例添加到植物和環(huán)境混合樣本DNA中，在擴(kuò)增PCR片段前，利用qPCR對(duì)內(nèi)參及樣本中的RID1基因拷貝數(shù)進(jìn)行定量，之后利用高通量測(cè)序確定內(nèi)參及整個(gè)樣本的reads數(shù)，最終確定定量豐度（quantitative abundance, QA），即微生物標(biāo)記基因（如16S rRNA、18S rRNA基因及ITS）相對(duì)于植物基因組的比值。此外，由于人們常用16S rRNA基因來(lái)對(duì)細(xì)菌進(jìn)行定量，但是細(xì)菌中16S rRNA基因存在一到多個(gè)拷貝現(xiàn)象，因此其結(jié)果也會(huì)造成偏差，因此，Wang等利用單細(xì)菌單拷貝持家基因rpoB來(lái)校準(zhǔn)16S rRNA基因，對(duì)樣本微生物群進(jìn)行絕對(duì)定量，其結(jié)果更加準(zhǔn)確。

 

　　由此可見，絕對(duì)定量法通過(guò)比較2個(gè)樣本中的含量來(lái)確定優(yōu)勢(shì)物種要比相對(duì)定量法比較相對(duì)豐度更加準(zhǔn)確，尤其是葡萄枝干病害機(jī)會(huì)性發(fā)病，長(zhǎng)期潛伏會(huì)造成病原菌量的變化和積累，病原菌可能因突破一定的量才開始顯癥，所以絕對(duì)定量對(duì)解釋枝干病害的發(fā)生機(jī)理以及確定核心微生物種至關(guān)重要。

 

　　此外，測(cè)序時(shí)擴(kuò)增子測(cè)序是利用特異性引物擴(kuò)增16S rRNA、18S rRNA及ITS的特定區(qū)域，也可根據(jù)研究目的不同，擴(kuò)增特定的功能基因來(lái)研究某一類微生物群體，例如擴(kuò)增nifH基因來(lái)研究可以進(jìn)行固氮作用的微生物群體。宏基因組及宏轉(zhuǎn)錄組則是對(duì)整個(gè)樣本所有物種的基因組及轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序，其關(guān)注的不單是某一個(gè)基因，能夠解釋葡萄枝干病害中發(fā)揮致病或抗病功能的主要物種以及相關(guān)的基因和作用通路等功能信息，但僅是理論上的預(yù)測(cè)結(jié)果，必須要與培養(yǎng)組學(xué)相結(jié)合，通過(guò)分離、培養(yǎng)鑒定出菌株并接種，才能進(jìn)一步驗(yàn)證所得信息結(jié)果，并將其用于后續(xù)研究。

 

 

　　葡萄枝干病害機(jī)會(huì)性發(fā)病的特點(diǎn)致使其發(fā)病時(shí)間難以確定，防治困難，相較于單一的生防菌的篩選與應(yīng)用，利用微生物組來(lái)防治是很有潛力的方法。葡萄與枝干病害的微生物組研究受到國(guó)內(nèi)外越來(lái)越多的關(guān)注，但目前研究較少，雖已有報(bào)道說(shuō)明葡萄微生物組與其枝干病害發(fā)生有關(guān)，但仍需對(duì)葡萄枝干病害相關(guān)的微生物組進(jìn)行大量研究，特別是絕對(duì)定量微生物組法等方法的引入，可以更準(zhǔn)確真實(shí)地闡明與葡萄枝干病害相關(guān)的微生物群落結(jié)構(gòu)，為將來(lái)的核心微生物組構(gòu)建及其精準(zhǔn)移植奠定基礎(chǔ)。