中國科學(xué)院分子植物科學(xué)卓越創(chuàng)新中心研究員朱健康領(lǐng)銜的研究團(tuán)隊(duì)，在植物基因組編輯領(lǐng)域再次取得重要進(jìn)展。研究人員采用修飾后的DNA片段作為供體，在水稻上建立了一種高效的片段靶向敲入和替換技術(shù)，高至50%的靶向敲入效率將極大地方便植物的研究和育種。7月6日，相關(guān)研究成果在線發(fā)表在Nature Biotechnology上。

 

　　近年來，CRISPR/Cas介導(dǎo)的植物基因組定點(diǎn)編輯技術(shù)在農(nóng)作物基因功能研究和精準(zhǔn)育種中發(fā)揮了重要作用，展現(xiàn)了廣闊的發(fā)展?jié)摿蛻?yīng)用前景。然而，CRISPR/Cas介導(dǎo)的植物基因組定點(diǎn)敲除技術(shù)只能在基因組特定位點(diǎn)產(chǎn)生隨機(jī)插入和刪除，精準(zhǔn)的片段插入和替換的效率一直很低，限制了其在植物研究和育種上的應(yīng)用。因此，迫切需要建立更高效的植物基因組片段插入和替換技術(shù)體系。

 

　　植物基因組編輯是朱健康研究組的重點(diǎn)研究領(lǐng)域，近年來獲得了一系列的進(jìn)展。作為該領(lǐng)域的難題，片段的靶向敲入和替換是科研人員的重要研究目標(biāo)，并圍繞這一目標(biāo)努力。在建立了病毒介導(dǎo)的同源重組（HDR）和各類單堿基編輯技術(shù)等多種方法的同時(shí)，科研人員開始嘗試在供體DNA片段上尋找突破點(diǎn)，以克服現(xiàn)有方法效率低、應(yīng)用范圍窄等缺陷。核酸修飾在人的RNAi療法和核酸疫苗等醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用。朱健康研究組通過嘗試，發(fā)現(xiàn)將供體片段同時(shí)進(jìn)行硫代修飾和磷酸化修飾后，能增強(qiáng)CRISPR/Cas9引導(dǎo)的靶向敲入效率（圖1）。研究團(tuán)隊(duì)先后在14個(gè)基因位點(diǎn)上靶向敲入了各類調(diào)控元件，包括翻譯增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，甚至整個(gè)啟動(dòng)子，供體片段最長達(dá)2049bp。通過對(duì)1393株各類T0代基因編輯水稻植株的分析發(fā)現(xiàn)，該方法的敲入效率可高達(dá)47.3%，平均效率為25%。高效的敲入效率甚至可以同時(shí)在四個(gè)位點(diǎn)上實(shí)現(xiàn)多基因靶向敲入?？梢灶A(yù)計(jì)，該技術(shù)的建立將使靶向敲入成為一項(xiàng)和靶向敲除一樣的常規(guī)實(shí)驗(yàn)，并被各個(gè)植物研究和育種單位廣泛應(yīng)用。

 

　　在此基礎(chǔ)上，朱健康研究團(tuán)隊(duì)又設(shè)計(jì)了一種片段精準(zhǔn)替換的策略，稱之為重復(fù)片段介導(dǎo)的同源重組（TR-HDR）方法。常規(guī)的HDR頻率極其低下，研究人員在前期的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，基因組上串聯(lián)重復(fù)片段間的HDR頻率非常高。利用這一現(xiàn)象，通過將修飾的片段靶向敲入至目標(biāo)位點(diǎn)后，人為制造這種串聯(lián)重復(fù)結(jié)構(gòu)，誘導(dǎo)TR-HDR去實(shí)現(xiàn)片段替換。采用該技術(shù)，在五個(gè)基因位點(diǎn)上實(shí)現(xiàn)了片段替換和原位的Flag標(biāo)簽蛋白的精準(zhǔn)融合，效率最高達(dá)到了11.4%（圖2）。這一技術(shù)突破將有助于植物學(xué)研究，并促進(jìn)農(nóng)作物定向遺傳改良的進(jìn)程。

 

　　朱健康是論文的通訊作者，副研究員陸鈺明和博士生田益夫?yàn)檎撐牡墓餐谝蛔髡摺Ｑ芯抗ぷ鞯玫街锌圃合嚓P(guān)經(jīng)費(fèi)的資助。

 

　　論文鏈接

　　圖1

　　圖2