遺傳與變異是物種進(jìn)化的基礎(chǔ)。通過(guò)物理、化學(xué)方法（如輻射誘變、EMS誘變）產(chǎn)生全基因組的隨機(jī)突變已經(jīng)成為農(nóng)作物育種的常規(guī)手段，但其中具有新型農(nóng)藝性狀突變體的篩選較為費(fèi)時(shí)、費(fèi)力。定向進(jìn)化（Directed Evolution）則通過(guò)創(chuàng)制目標(biāo)基因的突變文庫(kù)，在施加一定選擇壓力下能夠快速獲得目的突變體。目前，植物基因的定向進(jìn)化通常先通過(guò)易錯(cuò)PCR、DNA合成或DNA重組等方法在體外產(chǎn)生目標(biāo)基因的突變文庫(kù)，再轉(zhuǎn)化到大腸桿菌或酵母中進(jìn)行功能篩選。然而，由于離開(kāi)原始的基因組和細(xì)胞環(huán)境，篩選出來(lái)的基因突變可能并不能完全反映出它在植物中的真實(shí)功能。更重要的是，大多數(shù)重要農(nóng)藝性狀無(wú)法在大腸桿菌或酵母中進(jìn)行篩選。因此，建立一種在植物原位進(jìn)行基因飽和突變和功能篩選的定向進(jìn)化新方法將有助于加快植物育種及重要功能基因研究的進(jìn)程。近日，中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所高彩霞研究組和李家洋研究組合作，構(gòu)建了新型的飽和靶向內(nèi)源基因突變堿基編輯器STEME，并在植物中實(shí)現(xiàn)了基因的定向進(jìn)化和功能篩選。
研究者將胞嘧啶脫氨酶APOBEC3A和腺嘌呤脫氨酶ecTadA-ecTadA7.10同時(shí)融合在nCas9 （D10A）的N端，并將抑制體內(nèi)尿嘧啶糖基化酶UDG的活性的UGI以融合或自由表達(dá)的形式置于nCas9 （D10A）的C端，共構(gòu)建了4種形式的雙堿基編輯器STEME（STEME-1至STEME-4）。STEME雙堿基編輯器均可以只在一個(gè)sgRNA引導(dǎo)下就可以誘導(dǎo)靶位點(diǎn)C>T和A>G的同時(shí)突變，顯著增加了靶基因堿基突變的飽和度及產(chǎn)生突變類型的多樣性。STEME-1在水稻原生質(zhì)體中C>T誘導(dǎo)效率高達(dá)61.61%，C>T和A>G同時(shí)突變的效率也高達(dá)15.50%。為了提高靶基因的堿基覆蓋度，研究者進(jìn)一步利用能夠識(shí)別NG PAM的變體Cas9-NG構(gòu)建了第5個(gè)雙堿基編輯器STEME-NG，發(fā)現(xiàn)只需要20個(gè)sgRNA就可以對(duì)OsACC上編碼56個(gè)氨基酸的序列實(shí)現(xiàn)近飽和的突變。
為了展示STEME在植物中的定向進(jìn)化能力，研究者設(shè)計(jì)了靶向OsACC羧基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域上400個(gè)氨基酸編碼序列的200個(gè)獨(dú)立的sgRNA，分別構(gòu)建到STEME-1或STEME-NG雙元載體上。將構(gòu)建好的雙元載體分為27個(gè)轉(zhuǎn)化組，每個(gè)組內(nèi)混合了等分子量的4至11個(gè)sgRNA載體，覆蓋80-142 bp的靶DNA區(qū)域，便于提高轉(zhuǎn)化效率和突變的高通量測(cè)序。經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化水稻愈傷，共獲得約6000株水稻再生苗。水培法煉苗10天后，對(duì)再生苗噴灑高效氟吡甲禾靈（Haloxyfop）進(jìn)行篩選，共發(fā)現(xiàn)四個(gè)除草劑抗性突變位點(diǎn)：P1927F、W2125C、S1866F和A1884P。除W2125C以外，其余三個(gè)抗性位點(diǎn)未曾在植物中有過(guò)報(bào)道。其中，P1927F與W2125C突變一樣表現(xiàn)出強(qiáng)除草劑抗性，具有較高的生產(chǎn)應(yīng)用潛能。基于同源蛋白結(jié)構(gòu)模型分析發(fā)現(xiàn)，這些氨基酸突變直接或間接地影響了除草劑結(jié)合口袋的構(gòu)象，從而降低了其對(duì)除草劑分子的結(jié)合能力而獲得除草劑抗性。
STEME技術(shù)體系的建立，對(duì)于原位（In situ）定向進(jìn)化植物的內(nèi)源功能基因提供了新型技術(shù)支撐，對(duì)農(nóng)作物分子設(shè)計(jì)育種具有重要意義。此外，STEME系統(tǒng)還有望應(yīng)用于不同細(xì)胞系、酵母或動(dòng)物中的非編碼區(qū)的順式作用元件的調(diào)控、動(dòng)物致病SNV的修正和抗藥位點(diǎn)的篩選等。該研究成果于2020年1月13日在線發(fā)表于《自然-生物技術(shù)》（Nature Biotechnology）雜志（DOI:10.1038/s41587-019-0393-7）。高彩霞研究組博士生李超、助理研究員張瑞以及李家洋研究組副研究員孟祥兵為本文共同第一作者，研究員高彩霞和李家洋為共同通訊作者。遺傳發(fā)育所陳宇航研究組和中科院微生物研究所邱金龍研究組參與了部分研究工作。該研究得到中科院戰(zhàn)略性先導(dǎo)專項(xiàng)、國(guó)家自然基金委等的經(jīng)費(fèi)資助。
圖：（a） STEME介導(dǎo)的雙堿基（C>T和A>G）編輯策略。（b） STEME-1介導(dǎo)的堿基編輯產(chǎn)物類型分布。（c） 利用STEME系統(tǒng)飽和突變OsACC CT結(jié)構(gòu)域流程圖。（d） STEME系統(tǒng)介導(dǎo)的OsACC氨基酸替換產(chǎn)生除草劑抗性。
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