近日，中國農(nóng)科院植保所抗病蟲作物生態(tài)安全評(píng)價(jià)與利用創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)在植物生物學(xué)領(lǐng)域的國際著名期刊《植物細(xì)胞》（The Plant Cell）上在線發(fā)表了題為“Efficient in situ epitope tagging of rice genes by nuclease-mediated prime editing”的研究論文，該研究借用基于CRISPR/Cas核酸酶的引導(dǎo)編輯系統(tǒng)，通過微同源介導(dǎo)末端連接途徑實(shí)現(xiàn)了水稻多個(gè)內(nèi)源基因的高效精準(zhǔn)標(biāo)記，為水稻內(nèi)源基因標(biāo)簽研究提供了全新的編輯策略。

 

　　標(biāo)簽蛋白便利于科學(xué)家研究蛋白質(zhì)的互作關(guān)系、信號(hào)通路和分子機(jī)制，被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)領(lǐng)域的分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和生物化學(xué)研究中。相對(duì)于傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因技術(shù)介導(dǎo)的外源標(biāo)簽蛋白研究，其過量表達(dá)有時(shí)會(huì)造成研究結(jié)果的不可靠性，通過基因編輯技術(shù)直接標(biāo)簽內(nèi)源靶基因創(chuàng)制材料，研究結(jié)果更能反映靶基因在細(xì)胞內(nèi)參與的生理生化過程和實(shí)際功能。長期以來，如何突破高效的植物內(nèi)源基因標(biāo)簽技術(shù)一直都是生物技術(shù)研究人員關(guān)注的重要課題。

 

　　在該研究中，研究人員首先借助多種優(yōu)化策略在水稻上建立了高效的引導(dǎo)編輯系統(tǒng)，測試靶位點(diǎn)的編輯效率高達(dá)95.83%。進(jìn)一步探索了基于CRISPR/Cas核酸酶的引導(dǎo)編輯系統(tǒng)，通過不同DNA修復(fù)途徑（非同源介導(dǎo)的末端連接/NHEJ和微同源介導(dǎo)的末端連接/MMEJ）在水稻內(nèi)源基因精準(zhǔn)標(biāo)記中的潛力。

 

　　結(jié)果表明兩種策略均能實(shí)現(xiàn)水稻內(nèi)源基因的精準(zhǔn)FLAG標(biāo)記，但MMEJ介導(dǎo)的 NM-PE策略在精準(zhǔn)性和效率上比NHEJ介導(dǎo)的 NN-PE策略更優(yōu)。此外，借助的SpRY和ScCas9核酸酶，松弛型的引導(dǎo)編輯器通過NM-PE策略成功實(shí)現(xiàn)內(nèi)源基因OsMPK3、OsMPK6、OsMPK7、OsMPK10、OsMPK11的精準(zhǔn)標(biāo)記，編輯效率高達(dá)70.83%，大大擴(kuò)展了NM-PE標(biāo)簽策略在水稻基因組中的應(yīng)用范圍。最后，研究人員探索了NM-PE在水稻內(nèi)源雙基因標(biāo)簽中的潛力，結(jié)果表明后代基因編輯群體擁有大量單、雙基因精準(zhǔn)標(biāo)簽植株以及基因敲除植株。綜上，基于CRISPR/Cas核酸酶介導(dǎo)的雙鏈DNA切割和微同源介導(dǎo)的末端連接途徑的NM-PE策略，可以實(shí)現(xiàn)水稻靶基因的多核苷酸精準(zhǔn)操作、精準(zhǔn)標(biāo)簽及敲除等，在未來水稻蛋白標(biāo)記組學(xué)研究、基因功能研究和遺傳改良方面具有很大的潛力，也為其它農(nóng)作物和經(jīng)濟(jì)作物相關(guān)研究提供的全新的思路。

 

　　中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所博士研究生李雪琪（海南專項(xiàng)）和博士研究生張素杰為本文共同第一作者，周煥斌研究員為通訊作者，團(tuán)隊(duì)多名成員共同合作完成，北京農(nóng)林科學(xué)院李少芳研究員、挪威生物經(jīng)濟(jì)研究所Carl Spetz研究員、青島農(nóng)業(yè)大學(xué)黃金光教授、中國農(nóng)科院植保所周雪平教授也參與了相關(guān)研究工作。該研究得到了農(nóng)業(yè)生物育種重大專項(xiàng)、國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院南繁專項(xiàng)基金、海南省種業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新工程等項(xiàng)目的支持。

 

　　論文鏈接：https://doi.org/10.1093/plcell/koae316