暨南大學理工學院汪勇教授課題組的碩士研究生劉雪在Food Chemistry期刊（中科院JCR 1區(qū)，影響因子6.306）發(fā)表了一篇關(guān)于應用制備型高效液相同時分離制備12種亞麻籽環(huán)肽單體研究的文章。論文標題為“A practical and fast isolation of 12 cyclolinopeptides （linusorbs） from flaxseed oil via preparative HPLC with phenyl-hexyl column”，蔡子哲副研究員為共同第一作者，張寧教授和汪勇教授指導并共為通訊作者。

 

　　研究背景：

 

　　亞麻籽，我國第四大油料作物，其不僅富含油脂、蛋白質(zhì)、50%的ω-3必需脂肪酸：α-亞麻酸等營養(yǎng)物質(zhì)，還富含木酚素，亞麻籽膠，環(huán)肽等特殊成分。環(huán)肽是一組從亞麻籽油中衍生的環(huán)狀疏水肽，由八個或九個氨基酸殘基組成，分子量約為1 kDa。與普通直鏈小分子肽相比，環(huán)肽化學性質(zhì)更穩(wěn)定，具有廣譜、高效的抗菌活性，能抗腫瘤，消炎，以及抗癌等作用，且具有高效的生物活性，其健康益處不斷被揭示。目前環(huán)肽制備主要分為四種：a）硅膠柱層析法；b）化學合成法；c）溶劑萃取法；d）液相制備法；然而硅膠法操作復雜，溶劑用量大，純度監(jiān)控難；化學合成法路線復雜，副產(chǎn)物多，純化困難，得率低；溶劑萃取法溶劑用量大，產(chǎn)量低，產(chǎn)物為多種環(huán)肽混合物；液相制備法僅用于1-2種環(huán)肽制備，其他環(huán)肽存在出峰重疊問題?，F(xiàn)階段亞麻籽環(huán)肽純化方法的不足，阻礙了進一步對其他環(huán)肽的生理活性的研究。因此本研究主要探討開發(fā)一種基于制備型HPLC同時分離環(huán)肽單體的實用方法以供后續(xù)生物活性研究參考。

 

　　研究方法：

 

　　本研究應用制備型高效液相色譜法進行環(huán)肽制備，對比了兩種不同制備柱型對于環(huán)肽分離制備的影響以及為了達到制備分離所需的最佳樣品濃度，對粗環(huán)肽在不同溶劑中的溶解度進行了測定，并進行了相應的評價。為了確保純度和效率，優(yōu)化了一系列參數(shù)，例如梯度設置，樣品進樣量，進樣濃度等。并通過離線ESI-MS和純度測試最終確認氨基酸殘基序列。

 

　　研究結(jié)果及結(jié)論：

 

　　開發(fā)了一種新穎的制備型高效液相色譜（HPLC）方法，可同時分離出12種環(huán)肽單體，包括CLF, CLG, CLC, CLE, CLN, CLN*, CLB,CLA, CLP, CLL, CLM和CLO。通過單因素實驗優(yōu)化最佳條件為：初始ACN（乙腈）比率（在水中）為40％，最終ACN比例為80％，流速16 mL/min，進樣量12.5 mg，進樣濃度80 mg/mL，分析時間21 min。經(jīng)分析液相確定，所純化化合物純度高于95.5%。在最佳的制備型HPLC條件下，可以純化超過10 mg的主要環(huán)肽，而對于次要環(huán)肽，從10次進樣后的收率也高于1 mg。這使得結(jié)構(gòu)確認，結(jié)構(gòu)修飾和更大范圍的生物活性規(guī)模測定成為可能。同時，每種制備方法的運行時間已大大減少到約20 min，這對于使用傳統(tǒng)液相儀器進行高通量制備提供了可行性。同時經(jīng)過串聯(lián)質(zhì)譜確認鑒定，總結(jié)出了環(huán)肽化合物的碎裂規(guī)律及核對了環(huán)肽化合物的結(jié)構(gòu)。所建立的方法，可以用于環(huán)肽單體的高效純化，得到的環(huán)肽單體純度高，質(zhì)量好，可為將來的環(huán)肽成產(chǎn)及進一步的生物活性評價提供一定實驗基礎。

 

　　研究工作得到了國家重點研發(fā)計劃（2018YFE0108400和2018YFD0401103），國家自然科學基金（31920103012和31901603），中國博士后科學基金（2019M663386），以及廣州市科技計劃項目（201903010049）等的支持資助。

 

　　參考文獻：

 

　　Liu, X, Cai, Z.Z., Lee, W. J., Lu, X. X., Martin J.T. Reaney, Zhang, J. P., Zhang, N. , & Wang, Y. A practical and fast isolation of 12 cyclolinopeptides （linusorbs） from flaxseed oil via preparative HPLC with phenyl-hexyl column. Food Chemistry, 2021, 351: 129318.

 

　　原文鏈接：http://doi.org/10.1016/j.foodchem.2021.129318

 

　　作者簡介：

 

　　張寧，博士，暨南大學教授，碩士生導師，主要從事食品生物技術(shù)和油料生物煉制方向的研究，已發(fā)表核心期刊以上論文80余篇，其中SCI文章10余篇。近5年主持國家重點研發(fā)計劃國際合作項目1項，省部級項目3項，主要參與國家級項目3項。參與授權(quán)國內(nèi)專利2項，美國專利1項。獲得2018年廣東省科技進步二等獎（第5），2017年糧油學會科學技術(shù)獎一等獎（第7），2016年中國食品科技學會科技創(chuàng)新獎二等獎（第6）。

 

　　蔡子哲，博士，暨南大學副研究員，本科為暨南大學國際學院食品質(zhì)量與安全2012級畢業(yè)生，博士畢業(yè)于中山大學藥學院生藥學，薩斯喀徹溫大學農(nóng)學院訪問學者。目前從事油料作物及其副產(chǎn)物的高值化加工和營養(yǎng)因子的制備分離研究。以第一作者（或通訊作者）發(fā)表SCI文章7篇，申請發(fā)明專利3項。目前主持國家自然科學基金青年項目，中國博士后基金面上項目各一項。

 

　　劉雪，暨南大學理工學院2018級食品系碩士，研究亞麻籽中環(huán)肽的高效制備及環(huán)肽的抗衰老功效評價。研究興趣包括基于木酚素和環(huán)肽的亞麻籽粕高值化研究，亞麻籽中營養(yǎng)成分木酚素和環(huán)肽的制備分析，熟練掌握制備型高效液相、分析液相、質(zhì)譜分析、光柵型多功能微孔板檢測儀等。