近日，Plant Biotechnology Journal在線發(fā)表了題為“Efficient multiplex genome editing by CRISPR/Cas9 in common wheat”的文章，報道了山東省農(nóng)科院作物所小麥分子團(tuán)隊研發(fā)的小麥多基因多靶點編輯技術(shù)體系，單基因三靶點同時編輯效率達(dá)到100%，雙基因六靶點同時編輯效率達(dá)到96%，三基因八靶點同時編輯效率達(dá)到37%，標(biāo)志著我國的小麥基因編輯效率達(dá)到國際領(lǐng)先水平。

 

　　基因組編輯技術(shù)是創(chuàng)制突破性種質(zhì)資源、加速育種進(jìn)程的有效手段。由于小麥?zhǔn)钱愒戳扼w，基因組復(fù)雜，要實現(xiàn)多個基因A、B、D三個基因組上的多靶點同時編輯非常困難。雖然小麥多基因編輯開展較早，并已有相關(guān)報道，但與水稻、玉米等作物相比，仍然存在編輯效率低、突變體純合慢等問題。針對上述問題，作物所小麥分子育種團(tuán)隊，通過載體元件的優(yōu)化改造，構(gòu)建出3個小麥多基因編輯載體系統(tǒng)，分別為基于Pol III 型啟動子的TRSP、tRNA和基于Pol II型啟動子的核酶系統(tǒng)。設(shè)計的3個gRNA分別靶向TaDA1、TaPDS和TaNCED1在A、B和D基因組上的8個位點。利用團(tuán)隊自主建立的高效的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的小麥轉(zhuǎn)基因技術(shù)和平臺，分別獲得了22、26和 27個T0代轉(zhuǎn)基因陽性株系，測序分析發(fā)現(xiàn)tRNA和核酶系統(tǒng)的編輯效率顯著高于TRSP系統(tǒng)，其中，核酶系統(tǒng)對TaPDS基因的編輯效率在A、B、D三個基因組上均達(dá)到100%，并且有22個株系出現(xiàn)白化表型，白化苗數(shù)為TRSP、tRNA系統(tǒng)的4.4倍。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，上述三個編輯系統(tǒng)均可實現(xiàn)三基因八靶點的同時編輯，其中tRNA和核酶系統(tǒng)同時編輯的效率分別為34.62%和37.04%，而TRSP系統(tǒng)僅為18.18%。

　　CRISPR/Cas9介導(dǎo)的小麥多基因編輯系統(tǒng)

 

　　為進(jìn)一步探究基因型和表型的關(guān)系，作者對單個株系中野生型和突變型基因的比例進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)核酶系統(tǒng)同時顯著提高了TaDA1和TaPDS突變型的比例，即核酶系統(tǒng)顯著降低了單個株系中基因野生型的比例。為量化基因型和表型的關(guān)系，作者以TaPDS為例，對綠苗（無表型）、嵌合體和白化苗中突變基因型的比例進(jìn)行統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)只有單個株系中A、B和D基因組上突變型比例平均值高于80.59%才會出現(xiàn)白化表型，低于69.10%為綠色。上述數(shù)據(jù)說明，核酶系統(tǒng)不僅編輯效率最高，而且顯著提高單個株系中A、B、D三個基因組上同源基因同時突變的幾率，使T0代獲得突變表型的幾率大大增加，該研究結(jié)果對小麥突變體表型鑒定具有非常好的指導(dǎo)意義。

 

　　山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所李根英研究員和李玉蓮副研究員為論文的共同通訊作者，助理研究員李吉虎和副研究員張淑娟為該文共同第一作者，美國馬里蘭大學(xué)的戚益平副教授作為作者之一，參與了本研究。該研究得到山東省農(nóng)業(yè)良種工程、國家重點研發(fā)計劃、國家自然科學(xué)基金、山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程和美國馬里蘭大學(xué)啟動基金的資助。

 

　　高效小麥基因基因編輯技術(shù)體系的建立，為明確小麥基因的功能、發(fā)現(xiàn)優(yōu)異基因資源、拓展基因的應(yīng)用范圍、加快開發(fā)自主知識產(chǎn)權(quán)功能基因的進(jìn)程提供強(qiáng)有力的技術(shù)支持，對于推動我國小麥基因組學(xué)和突破性種質(zhì)創(chuàng)新具有重要價值和意義。