柑橘是世界第一大類(lèi)水果，也是我國(guó)南方最重要的果樹(shù)作物。柑橘喜溫畏寒，低溫脅迫嚴(yán)重制約了柑橘產(chǎn)業(yè)的綠色健康發(fā)展。枳（Citrus trifoliata L.）是重要的柑橘耐寒資源，為挖掘抗寒基因提供了珍貴材料。過(guò)去很多研究表明，植物在低溫脅迫下會(huì)積累脯氨酸減輕傷害，但低溫下脯氨酸積累的分子調(diào)控機(jī)制尚不明晰。

 

　　吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS1，Delta-1-pyrroline-5-carboxylate synthetase 1）介導(dǎo)的脯氨酸生物合成在植物逆境響應(yīng)中具有重要的保護(hù)作用。水楊酸受體NPR（NonEXPRESSOR OF PATHOGENESIS-RELATED GENES）和TGA（TGACG sequence-specific binding proteins）轉(zhuǎn)錄因子是水楊酸（salicylic acid，SA）信號(hào)通路的核心組分。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，參與脯氨酸合成的基因CtrP5CS1受到低溫強(qiáng)烈的誘導(dǎo)表達(dá)。然而在低溫脅迫下脯氨酸的合成調(diào)控機(jī)制及上游信號(hào)通路仍知之甚少。

 

　　課題組以響應(yīng)低溫CtrP5CS1啟動(dòng)子片段的為誘餌開(kāi)展酵母單雜交文庫(kù)篩選實(shí)驗(yàn)，挖掘到一個(gè)bZIP家族轉(zhuǎn)錄因子CtrTGA2。通過(guò)Y1H、EMSA、ChIP-qPCR和LUC等實(shí)驗(yàn)證明了CtrTGA2能特異性結(jié)合CtrP5CS1啟動(dòng)子上的TGACG序列并激活該基因表達(dá)。隨后，通過(guò)轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)表明CtrTGA2通過(guò)調(diào)控CtrP5CS1表達(dá)和脯氨酸合成積累從而增強(qiáng)枳抗寒性。此外，CtrTGA2直接調(diào)控參與SA生物合成基因CtrICS1的表達(dá)，形成正反饋回路，增強(qiáng)CtrTGA2介導(dǎo)的CtrP5CS1的轉(zhuǎn)錄激活。研究人員進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)CtrTGA2受SA強(qiáng)烈誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)CtrNPR3可以與CtrTGA2互作并減弱CtrTGA2對(duì)靶基因的激活，CtrNPR3負(fù)調(diào)控枳抗寒性，而外施SA可部分解除該抑制作用。

 

　　綜上，該研究表明TGA2-P5CS1/ICS1模塊通過(guò)整合SA信號(hào)調(diào)控脯氨酸合成參與柑橘低溫應(yīng)答，解析了低溫脅迫下脯氨酸積累的分子機(jī)制，豐富了植物低溫逆境下代謝物調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為柑橘抗寒育種和研發(fā)緩解柑橘低溫傷害的技術(shù)提供了理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。

 

　　華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝林學(xué)學(xué)院劉繼紅教授為該論文通訊作者，博士畢業(yè)生肖瑋為該論文第一作者，李春龍教授為本研究提供了指導(dǎo)和幫助。劉繼紅教授課題組長(zhǎng)期致力于柑橘逆境應(yīng)答與調(diào)控研究，重點(diǎn)關(guān)注脯氨酸、多胺和甜菜堿等代謝物在柑橘應(yīng)答非生物脅迫的作用及調(diào)控機(jī)制。2024年，課題組有關(guān)研究成果已發(fā)表于Journal of Integrative Plant Biology（在讀博士生李夢(mèng)迪）、Plant Physiology（已畢業(yè)博士生肖鵬）、Plant Journal（博士后Mahida Khan，已畢業(yè)博士生張楊）、Horticulture Research（已畢業(yè)博士生明如宏）等國(guó)際知名期刊，并在Plant Biotechnology Journal和Journal of Integrative Plant Biology發(fā)表了多胺方面的綜述文章。相關(guān)研究依托華中農(nóng)業(yè)大學(xué)果蔬園藝作物種質(zhì)創(chuàng)新與利用全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室平臺(tái)，得到了國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2022YFD1200503）和國(guó)家自然科學(xué)基金（32272644, 32330095）等項(xiàng)目的資助。

 

　　【英文摘要】

 

　　Plants subjected to cold stress have been observed to accumulate proline, but the underlying regulatory mechanism remains to be elucidated. In this study, we identified a Pyrroline-5-Carboxylate Synthetase （P5CS）-encoding gene （CtrP5CS1） from trifoliate orange （Citrus trifoliata L.）， a cold-hardy citrus species, as a critical gene for cold-induced proline accumulation. CtrTGA2 bound directly to the TGACG motif of the CtrP5CS1 promoter and activated its expression. Moreover, CtrTGA2 functioned positively in cold tolerance via modulation of proline synthesis by regulating CtrP5CS1 expression. Up-regulation of CtrP5CS1 and CtrTGA2 under cold stress was dependent on salicylic acid （SA） biosynthesis. CtrTGA2 directly regulated the expression of CtrICS1, a gene encoding isochorismate synthase （ICS） involved in SA biosynthesis, forming a positive feedback loop to intensify the CtrTGA2-mediated transcriptional activation of CtrP5CS1. The cold-induced SA receptor NonEXPRESSOR OF PATHOGENESIS-RELATED GENES3 （CtrNPR3） interacted with CtrTGA2 to inhibit its transcriptional activation activity; however, the inhibition was released by SA. Our results uncover the CtrTGA2-CtrP5CS1/CtrICS1 regulatory module that orchestrates the SA signal to regulate proline synthesis, giving important insights into the transcriptional mechanism underlying proline accumulation in plants under cold stress.