基因的定向進(jìn)化通過模仿自然選擇的過程，以將基因產(chǎn)生的蛋白功能導(dǎo)向自定義的目標(biāo)，其過程包括突變的產(chǎn)生、篩選和擴(kuò)增。相較于體外定向進(jìn)化技術(shù)，基于CRISPR的原位定向進(jìn)化技術(shù)更適用于定向進(jìn)化多數(shù)作物關(guān)鍵基因，以達(dá)到作物改良的目的。如何創(chuàng)制變異類型更加豐富的飽和突變體文庫(kù)是原位定向進(jìn)化技術(shù)的關(guān)鍵。近日，萬(wàn)建民院士團(tuán)隊(duì)開發(fā)了新型的多重正交堿基編輯器MoBE和隨機(jī)化多sgRNA組裝技術(shù)，極大地提升了原位定向進(jìn)化所需的潛在突變豐度，并獲得了新的抗除草劑水稻突變植株。
研究者首先采用RNA配體招募形式的堿基編輯器構(gòu)象，篩選出高效的腺嘌呤脫氨酶TadA9和胞嘧啶脫氨酶CDA1。利用T2A“自剪切”肽將nCas9 （D10A）切口酶、腺嘌呤堿基編輯模塊（TadA9-N22p）和胞嘧啶堿基編輯模塊（TadA9-N22p）串聯(lián)在同一個(gè)Ubi-1啟動(dòng)子后面，構(gòu)建了多重正交堿基編輯器MoBE。在新開發(fā)的嵌合RNA配體作用下，MoBE介導(dǎo)的A>G和C>T雙堿基編輯效率高達(dá)73.9%，其中兩種堿基同時(shí)編輯的產(chǎn)物平均占比達(dá)97%。在三種不同RNA配體形式的作用下，MoBE可以在多位點(diǎn)上分別實(shí)現(xiàn)高效的ABE、CBE和A&CBE多重編輯。同時(shí)，研究者還開發(fā)了MoBE-HF，顯著降低了MoBE的脫靶風(fēng)險(xiǎn)。
為實(shí)現(xiàn)高通量的飽和編輯sgRNA設(shè)計(jì)，研究者開發(fā)了在線工具PlantBE-CODE （http://pgec.njau.edu.cn/plantbe-code）。以飽和突變OsACC的第34個(gè)外顯子為例，利用同尾酶開發(fā)了隨機(jī)化多sgRNA組裝技術(shù)，并通過添加Barcode序列來(lái)追蹤靶點(diǎn)和所招募的編輯器信息。在隨機(jī)化多sgRNA文庫(kù)中，每串聯(lián)一個(gè)sgRNA表達(dá)模塊，不同靶點(diǎn)和不同編輯器的組合類型便會(huì)顯著增加。將MoBE和隨機(jī)化雙sgRNA文庫(kù)相結(jié)合，原位定向進(jìn)化水稻OsACC內(nèi)源基因。在含1.5倍濃度高效氟吡甲禾靈（Haloxyfop）的培養(yǎng)基篩選壓力下，獲得了新的抗除草劑的突變體V1703I-W2125C-Hetero、R2126T-G2127A-E2327K/W2125C-E2327K-Biallelic、D1970N/W2125C-Biallelic和I2139N/F2207L-Biallelic等。
MoBE和隨機(jī)化多sgRNA組裝技術(shù)的建立，進(jìn)一步拓展了基于CRISPR的作物原位定向進(jìn)化技術(shù)體系，為作物基因組編輯新種質(zhì)創(chuàng)制和挖掘優(yōu)良等位變異提供了新的工具支撐。該研究成果于2023年08月12日在線發(fā)表于植物學(xué)知名期刊Plant Biotechnology Journal （doi: 10.1111/pbi.14156）。
南京農(nóng)業(yè)大學(xué)已畢業(yè)碩士生張傲、在讀博士生單調(diào)風(fēng)和孫巖為本文共同第一作者，萬(wàn)建民院士和李超教授為共同通訊作者。南京農(nóng)業(yè)大學(xué)劉裕強(qiáng)教授、吳玉峰教授、董小鷗教授、江玲教授和中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所王延鵬研究員等也參與了部分研究工作。該研究得到農(nóng)業(yè)農(nóng)村部、江蘇省前沿引領(lǐng)技術(shù)基礎(chǔ)研究專項(xiàng)、海南省崖州灣種子實(shí)驗(yàn)室和中國(guó)科協(xié)等項(xiàng)目資助。
原文鏈接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/pbi.14156
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