近期，江南大學生物工程學院周哲敏教授團隊在基于生物傳感器的酶高通量篩選平臺開發(fā)方面取得重要進展，研究成果“Construction and Application of a High-Throughput In Vivo Screening Platform for the Evolution of Nitrile metabolism-Related Enzymes based on a Desensitized Repressive Biosensor”正式發(fā)表于ACS Synthetic Biology （IF=5.11）（ https://doi.org/10.1021/acssynbio.1c00642）。

 

　　腈類化合物是合成高附加值酰胺類和羧酸類化合物的重要工業(yè)原料，腈代謝相關(guān)酶（腈水解酶、酰胺酶、腈水合酶等）是驅(qū)動這一轉(zhuǎn)化過程的理想生物催化劑。然而，這些酶的高活性改造因為缺乏高通量篩選方法而受到制約。生物傳感器能夠?qū)⒚富钆c細胞表型進行偶聯(lián)，用于酶的體內(nèi)超高通量篩選。煙酸是腈水解酶、酰胺酶和腈水合酶催化煙腈的終產(chǎn)物，因此，開發(fā)煙酸生物傳感器可搭建以上三種酶的通用篩選平臺。

 

　　研究者首先利用枯草芽孢桿菌來源的煙酸抑制型轉(zhuǎn)錄因子NadR及其靶標啟動子，在大腸桿菌中構(gòu)建煙酸生物傳感器NAsensor。進一步，通過易錯PCR的方式對轉(zhuǎn)錄因子NadR進行改造，成功篩選得到在0-50mM煙酸濃度范圍內(nèi)具備良好梯度信號輸出的NAsensor。利用同源建模、分子對接及動力學模擬，他們發(fā)現(xiàn)NadR中引入的隨機突變降低了與配體煙酸的親和力，且配體結(jié)合自由能的改變與NadR靈敏度的降低強相關(guān)。另外，分子動力學分析顯示，NadR突變體DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的柔性明顯降低，暗示其結(jié)合DNA能力下降，有利于檢測梯度的建立。

 

　　基于改造后的NAsensor，研究者設計和構(gòu)建了腈水解酶和酰胺酶的體內(nèi)高通量篩選平臺。利用CAST策略構(gòu)建腈水解酶和酰胺酶的隨機組合突變體庫，篩選獲得高活性突變體。在此基礎(chǔ)上，研究者又拓展NAsensor用于篩選腈水合酶，在NAsensor中引入了煙酰胺轉(zhuǎn)化模塊，使得腈水合酶催化煙腈的產(chǎn)物煙酰胺能夠被迅速轉(zhuǎn)化為煙酸，進而被NAsensor檢測。利用拓展的NAsensor，實現(xiàn)了熱穩(wěn)定腈水合酶的高活性進化。值得注意的是，通過該平臺篩選到的高活性突變體，不僅僅催化煙腈/煙酰胺的活性大幅提升，對結(jié)構(gòu)類似的其他芳香族底物的活性同樣提升明顯。本研究成果說明基于抑制型的生物轉(zhuǎn)錄因子更適合梯度篩選的生物傳感器構(gòu)建，同時也將大力促進腈類化合物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的生物制備。

 

　　江南大學生物工程學院博士后韓來闖為本文第一作者，周哲敏教授為通訊作者。該研究得到包括江蘇省自然科學基金（BK20210470）、中國博士后科學基金（2021M701461）等項目資助。