近日，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)鄧秀新院士團(tuán)隊(duì)在柑橘自交不親和調(diào)控機(jī)制研究上的新成果以Downregulated expression ofS2-RNase attenuates self-incompatibility in “Guiyou No. 1” pummelo為題在Horticulture Research在線發(fā)表。

 

　　柑橘屬蕓香科柑橘亞族，是熱帶、亞熱帶多年生木本果樹，在世界上廣泛栽培種植，是世界公認(rèn)的第一大水果，其產(chǎn)業(yè)在國(guó)民經(jīng)濟(jì)中占據(jù)重要地位?，F(xiàn)有主栽柑橘品種中很多均具有自交不親和特性，如沙田柚（Chai et al., 2010）、八朔（Yamashita and Tanimoto, 1985）、日向夏（Honsho et al., 2009）、無籽砂糖橘（Ye et al., 2009）、克里曼丁橘（Caruso et al., 2012）、W.默科特（Gambetta et al., 2013）、香水檸檬（Zhang et al., 2015）及“Kagzi Kalan”檸檬（Kakade et al., 2017）等。

 

　　在生產(chǎn)實(shí)踐中，自交不親和性是制約柑橘果實(shí)產(chǎn)量提高及品質(zhì)改良的重要因素之一。以沙田柚為例，由于其具有典型的配子體自交不親和特性，自交座果率僅0.3%，使得生產(chǎn)實(shí)踐中必須通過配置酸柚授粉樹或進(jìn)行人工授粉以提高座果率，不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且果實(shí)種子多，在勞動(dòng)力短缺及消費(fèi)者對(duì)果實(shí)品質(zhì)要求不斷提高的今天，這成為制約產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的一個(gè)重要問題。因此，發(fā)掘和培育柑橘自交親和突變資源，進(jìn)而解析自交親和突變分子機(jī)制，為未來有針對(duì)性開展遺傳改良培育自交親和新種質(zhì)具有重要的理論及實(shí)踐意義。

 

　　課題組前期已通過正向遺傳學(xué)等手段首次闡明控制蕓香科柑橘自交不親和機(jī)制屬于S-RNase酶介導(dǎo)的配子體自交不親和類型（Liang et al.,Nature Plants, 2020）。本研究以自交親和沙田柚優(yōu)良變異株系——“桂柚1號(hào)”為材料，不同于沙田柚具有典型的配子體自交不親和特性——自交坐果率極低，“桂柚1號(hào)”則表現(xiàn)出穩(wěn)定的自交親和特性，生產(chǎn)上無需人工授粉。

 

　　不同授粉后雌蕊花粉管的熒光圖像

 

　　研究人員對(duì)沙田柚和“桂柚1號(hào)”經(jīng)過連續(xù)兩年的自交授粉及坐果率觀察，證實(shí)了‘桂柚1號(hào)’的自交親和表型穩(wěn)定，授粉5天后，其花粉管可以完全到達(dá)花柱基部。人工自交授粉后，“桂柚1號(hào)”的坐果結(jié)實(shí)率可達(dá)30%。而兩者相互雜交授粉結(jié)果表明，沙田柚的花粉在“桂柚1號(hào)”的柱頭上也表現(xiàn)出穩(wěn)定的親和性，而“桂柚1號(hào)”的花粉在沙田柚的柱頭則表現(xiàn)為不親和，由此表明，“桂柚1號(hào)”親和突變發(fā)生在花柱端。S基因型鑒定結(jié)果表明“桂柚1號(hào)” 與沙田柚均為S1S2，對(duì)“桂柚1號(hào)”自交子代基因型鑒定結(jié)果表明，其子代基因型S1S1:S1S2:S2S2的分離比為0:1:1，結(jié)合RNA-Seq及qRT-PCR分析，發(fā)現(xiàn)S2-RNase基因在“桂柚1號(hào)”花柱中完全不表達(dá)，且Western Blot結(jié)果也證實(shí)，在“桂柚1號(hào)”花柱中未檢測(cè)到S2-RNase蛋白。以上結(jié)果表明，S2-RNase基因的不表達(dá)是造成“桂柚1號(hào)”自交親和的原因。

 

 

　　為了進(jìn)一步解析“桂柚1號(hào)”自交親和的分子機(jī)制，本研究基于三代PacBio測(cè)序平臺(tái)，對(duì)“桂柚1號(hào)”進(jìn)行了全基因組測(cè)序，共得到3969910472條subreads，經(jīng)分型組裝，得到566.29 Mb包含兩個(gè)S單倍型的基因組序列。并對(duì)得到的S1和S2兩個(gè)單倍型的序列信息進(jìn)行了手動(dòng)注釋。與已經(jīng)發(fā)表的沙田柚S1和S2單倍型相比，發(fā)現(xiàn)在控制柑橘自交不親和的S位點(diǎn)上，“桂柚1號(hào)”與沙田柚在序列上并不存在差異，該位點(diǎn)上也并未檢測(cè)到Indels和結(jié)構(gòu)變異（SVs）。且發(fā)現(xiàn)造成“桂柚1號(hào)”自交親和的S2-RNase基因上游啟動(dòng)子區(qū)域（5kb）及下游非編碼區(qū)（5kb）在“桂柚1號(hào)”及沙田柚中，序列完全一致，并無SNP的差異。全基因組甲基化分析也顯示，“桂柚1號(hào)”和沙田柚花柱中甲基化水平并不存在顯著差異，其中甲基化相關(guān)基因和去甲基化相關(guān)基因的表達(dá)也無明顯差異。由此表明，“桂柚1號(hào)”中S2-RNase基因的不表達(dá)并非由于序列變異和表觀甲基化修飾所導(dǎo)致。

　　'ST‘和'GY’柚花藥和花柱組織的差異表達(dá)分析

 

　　針對(duì)“桂柚1號(hào)”和沙田柚花柱和花藥轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)分析表明，花柱中的基因表達(dá)譜在“桂柚1號(hào)”和沙田柚中存在顯著差異，推測(cè)可能是轉(zhuǎn)錄調(diào)控水平的差異導(dǎo)致了S2-RNase基因表達(dá)的差異。轉(zhuǎn)錄組分析共得到29個(gè)候選的差異轉(zhuǎn)錄因子基因，經(jīng)酵母單雜交和LUC實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，最終發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子CgHB40可能參與了S2-RNase基因的調(diào)控，其在“桂柚1號(hào)”和沙田柚中的差異表達(dá)，可能是造成“桂柚1號(hào)”自交親和的原因，關(guān)于該基因的功能也需要更多的后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

 

　　大多數(shù)開花植物的自交不親和性由S-RNase所介導(dǎo)，目前為止圍繞S位點(diǎn)上S-RNase/SLF的功能及自交不親和機(jī)制研究在梨（張紹鈴等，2012）、蘋果（李天忠等，2011）、杏（陳學(xué)森等，2000）及馬鈴薯（黃三文等，2021）中研究的較為深入，部分研究已經(jīng)走在世界前列，但至今對(duì)于S-RNase上游調(diào)控機(jī)制的研究至今鮮有報(bào)道。本研究證實(shí)雌蕊的突變通過影響未知的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，導(dǎo)致“桂柚1號(hào)”自交不親和性的喪失。通過對(duì)SV變異、甲基化水平和基因表達(dá)數(shù)據(jù)的分析，確定了一個(gè)可能參與S2-RNase基因調(diào)控的候選轉(zhuǎn)錄因子（CgHB40）。這項(xiàng)工作極大的促進(jìn)了人們對(duì)柑橘自交不親和系統(tǒng)遺傳基礎(chǔ)的理解，也為后續(xù)S-RNase基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究奠定了一定的基礎(chǔ)。

 

　　我校園藝林學(xué)學(xué)院博士研究生胡健兵為論文第一作者，柴利軍副教授為論文通訊作者。博士研究生徐強(qiáng)、劉晨晨，現(xiàn)工作于廣西壯族自治區(qū)亞熱帶作物研究所的已畢業(yè)碩士韋壯敏，廣西特色作物研究院劉冰浩、鄧崇嶺和陳傳武，廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院陳香玲和湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院陳鵬等人參與本研究工作。本研究得到國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃，國(guó)家自然科學(xué)基金，中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)及湖北省自然科學(xué)基金等項(xiàng)目的資助。

 

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