近日江南大學生物工程學院周哲敏教授團隊在基因編輯研究方面取得突破，成功構建了適用于蛋白質(zhì)體內(nèi)原位進化的堿基編輯器。研究成果“Development of a base editor for protein evolution via in situ mutation in vivo”發(fā)表于《Nucleic Acids Research》雜志（JCR一區(qū)，影響因子：16.971）（https://doi.org/10.1093/nar/gkab673）。

 

　　蛋白質(zhì)定向進化在生命科學領域舉足輕重。傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)定向進化通過體外突變與高通量篩選相結(jié)合的手段獲得優(yōu)勢突變體。然而，受限于外源重組表達技術以及體外功能檢測技術瓶頸，傳統(tǒng)研究手段難以對膜蛋白、蛋白復合體及毒性蛋白等進行體外進化。

 

　　為了解決這一問題，周哲敏教授研究團隊獨辟蹊徑，開發(fā)了基于CRISPR-Cas系統(tǒng)介導的堿基編輯器實現(xiàn)蛋白質(zhì)體內(nèi)原位進化的新方法。該研究以枯草芽孢桿菌為底盤細胞，首先將來源于Petromyzon marinus的胞嘧啶脫氨酶（PmCDA）和nCas9蛋白以新的方式融合后整合到底盤基因組，構建出一種整合型高效堿基編輯器（CRISPR-CDA-nCas9-UGI）。該編輯器能夠在一個較寬的編輯窗口（15-20 nt）內(nèi)發(fā)生高效C→T轉(zhuǎn)換，編輯效率接近100%；編輯窗口寬度及編輯效率能夠通過誘導劑濃度、持續(xù)迭代等手段實現(xiàn)調(diào)節(jié)，且可靶向多個基因以及單個基因的多個位點，這些特點保證了突變的高效性和突變體的多樣性。該編輯器適用于構建蛋白質(zhì)原位突變體文庫，并從中篩選出合適的突變體。基于該系統(tǒng)研究者分別對膜蛋白復合體Sec轉(zhuǎn)運酶和bacitracin抗性蛋白（BceB）展開體內(nèi)原位定向進化，成功獲得了分泌效率提升3.6倍的突變株以及對bacitracin產(chǎn)生不同敏感度的突變株。經(jīng)過新一代高通量測序，發(fā)現(xiàn)該系統(tǒng)的脫靶率很低，表明系統(tǒng)具有極高的特異性。

 

　　本研究將基于CRISPR的堿基編輯系統(tǒng)和蛋白質(zhì)定向進化相聯(lián)系，在CRISPR-Cas已有的基因插入、刪除及參與基因表達調(diào)控等功能之外，成功拓展出了新的應用領域。研究不僅為復雜蛋白質(zhì)和蛋白復合體的功能進化提供了新的技術，也為構建含有進化蛋白質(zhì)的底盤細胞提供了新的研究思路。

 

　　周哲敏教授為該論文的通訊作者，江南大學19級博士生郝文亮和我院崔文璟副教授為該論文的共同第一作者。上述研究工作得到了國際科技合作創(chuàng)新重點項目（2017YFE0129600）、國家自然科學基金（21878125）、江蘇省自然科學基金（BK20181206）等項目的資助。