近期，南京農業(yè)大學動物科技學院劉紅林教授、申明副研究員團隊在豬卵泡發(fā)育的分子機制研究中取得重要進展，兩篇高水平研究論文“Oocytes and hypoxanthine orchestrate the G2-M switch mechanism in ovarian granulosa cells”和“FOXO1 mediates hypoxia-induced G0/G1 arrest in ovarian somatic granulosa cells by activating the TP53INP1-p53-CDKN1A pathway”連續(xù)發(fā)表在發(fā)育生物學權威雜志《Development》。

 

　　雌性動物出生后，卵母細胞一直停滯在減數(shù)第I次分裂前期的雙線期。直至初情期到來后，在LH激素峰的作用下，減數(shù)分裂才能重新啟動。早在上世紀80年代，美國科學院院士John Eppig教授發(fā)現(xiàn)卵泡液中含有抑制卵母細胞自發(fā)恢復減數(shù)分裂的小分子物質。次黃嘌呤（Hx）被證明是這些小分子抑制物中的主要活性成分，可通過抑制磷酸二酯酶的活性提高cAMP水平，抑制卵母細胞促成熟因子（MPF，即CDKl/cyclin B復合物）活性，從而維持卵母細胞減數(shù)分裂抑制。卵泡顆粒細胞與卵母細胞處于相同的卵泡環(huán)境中，顆粒細胞的增殖同樣需要MPF活性，但次黃嘌呤對顆粒細胞增殖的影響卻缺少報道。

 

　　本研究首次證明，生理濃度的Hx能夠通過抑制MPF活性，將顆粒細胞阻斷在G2期，并且這種抑制作用的解除依賴于TGF-β1的添加，而不是FSH、LH、IGF1、EGF等激素或生長因子。進一步研究揭示，在卵泡中，卵母細胞可通過分泌GDF9和BMP15這兩種TGF-β超家族成員解除Hx引起的顆粒細胞有絲分裂阻滯，其機制在于：GDF9和BMP15與顆粒細胞上的GDF9/BMP15受體結合后，通過激活ERK1/2通路，抑制Wee1活性，從而抑制CDK1的Thr l4和Tyr l5位點磷酸化。ERK1/2還可激活CDC25B磷酸酶活性，進一步降低Thr l4和Tyr l5這兩個位點磷酸化水平，從而增強CDK1活性，使被Hx抑制的MPF活性得以恢復，因此誘導顆粒細胞從G2進入M期，促進有絲分裂的進行。值得注意的是，GDF9/BMP15受體含量較低的顆粒細胞不僅對Hx誘導的G2期阻滯更敏感，而且更容易從卵泡壁脫落成為游離顆粒細胞（dGCs）。同時，Hx誘導的G2期阻滯會引發(fā)dGCs的凋亡。由于顆粒細胞脫落和凋亡是卵泡發(fā)生閉鎖的重要特征，可以預見顆粒細胞GDF9及BMP15受體的差異表達可能是引起卵泡選擇性閉鎖的潛在原因。

 

　　卵泡發(fā)育是雌性生殖的基礎，卵母細胞減數(shù)分裂抑制和顆粒細胞有絲分裂增殖是確保卵泡正常發(fā)育必須具備的兩個基本條件。然而，在同一卵泡環(huán)境中如何實現(xiàn)二者的協(xié)調統(tǒng)一尚缺乏足夠的認識。本研究為這一問題的回答提供了可能性的解釋，加深了人們對卵泡發(fā)育機制的了解。另一方面，目前尚不明確卵母細胞是否參與卵泡閉鎖的啟動。本研究表明，Hx抑制細胞增殖后顯著增加了顆粒細胞凋亡；而卵母細胞分泌因子可消除Hx對顆粒細胞有絲分裂的抑制作用，進而阻止顆粒細胞凋亡和脫落。這些發(fā)現(xiàn)為研究“卵母細胞是否參與卵泡閉鎖的啟動”指明了可能的途徑：即卵母細胞分泌功能障礙導致顆粒細胞無法解除Hx引起的增殖阻滯從而啟動了卵泡閉鎖。

　　卵泡低氧微環(huán)境影響豬卵泡顆粒細胞增殖的關鍵機制被探明

 

　　卵巢卵泡生長發(fā)育是母豬發(fā)情排卵的生理基礎。生長中的卵泡具有兩種命運：繼續(xù)發(fā)育與退化閉鎖，卵泡命運決定機制一直是繁殖生物學領域需要解決的核心科學問題。卵泡發(fā)育依賴于顆粒細胞的活躍增殖，顆粒細胞增殖活性顯然與卵泡命運相關。然而，顆粒細胞增殖活性隨著卵泡發(fā)育逐漸減弱。那么，是什么原因導致卵泡發(fā)育過程中顆粒細胞增殖潛力的逐步降低？

 

　　在哺乳動物卵泡中，毛細血管分布于卵泡膜層，未能突破基膜進入顆粒細胞層，導致顆粒細胞出現(xiàn)低氧狀態(tài)。隨著卵泡發(fā)育變大，顆粒細胞層與卵泡毛細血管的距離越來越遠，導致顆粒細胞低氧程度不斷加劇。那么低氧是否與顆粒細胞增殖狀態(tài)有關？

 

　　本研究采用流式細胞術檢測了數(shù)百個豬有腔卵泡顆粒細胞周期，結果發(fā)現(xiàn)，隨著卵泡直徑的增加，卵泡顆粒細胞G0/G1 期比例顯著升高。不僅如此，研究還發(fā)現(xiàn)，同樣大小的豬有腔卵泡其顆粒細胞G0/G1 期比例也存在較大差異。試驗剝取了近200 個直徑4 mm 左右的豬卵泡，分離的顆粒細胞進行細胞周期檢測，根據(jù)G0/G1 的比例，分為G0/G1 比例高組和G0/G1 比例低組，進行轉錄組測序分析。測序結果GO 分析發(fā)現(xiàn)，低氧應答是調控顆粒細胞G0/G1 阻滯的主要生物學過程。利用體外低氧模型，進一步證實低氧是誘導卵巢顆粒細胞G0/G1 阻滯，抑制顆粒細胞增殖的重要因素。

 

　　為明確低氧調控顆粒細胞周期的下游通路，課題組對轉錄組測序結果進行KEGG pathway 分析，發(fā)現(xiàn)在G0/G1 比例高組的顆粒細胞中顯著富集到FOXO 信號通路。進一步研究揭示，在體內外低氧條件下，G0/G1期顆粒細胞的比例升高伴隨著FOXO1核轉運的增多，而敲降FOXO1后，可促進顆粒細胞從G0/G1進入S期。

 

　　根據(jù)測序結果，本研究從差異基因中找到了一個極顯著上調的候選基因TP53INP1。生物信息學分析顯示，TP53INP1 基因啟動子區(qū)存在FOXO1 的結合位點。利用采用熒光素酶活性分析、染色質免疫共沉淀（ChIP）等技術，研究證實TP53INP1是FOXO1靶基因。同時，TP53INP1 與p53 存在復雜的相互調控，一方面TP53INP1 是p53 下游靶基因，另一方面，TP53INP1 能夠激活p53 活性，表現(xiàn)為對p53的正反饋調控。進一步通過ChIP、RNAi等技術探索FOXO1/TP53INP1/p53軸的機制及功能，結果表明：在低氧環(huán)境中，顆粒細胞FOXO1入核直接上調了其靶基因TP53INP1表達，進而激活p53，而p53作為調控CDKN1A表達的關鍵轉錄因子上調了CDKN1A表達，最終CDKN1A發(fā)揮細胞周期抑制功能引起顆粒細胞增殖阻滯。

 

　　本研究首次從低氧角度解析卵泡顆粒細胞增殖調控機制，這將有助于明確卵泡命運決定的本質，并有可能為調控卵泡發(fā)育提供新的作用靶點，從而為提高家畜繁殖力以及人類不孕癥的臨床治療提供途徑。

 

　　論文一作為博士生李誠瑜，通訊作者申明副研究員、劉紅林教授，劉昭君、吳剛、周佳奇、李偉建、劉爍等研究生也參與了上述研究。該研究得到了國家自然基金項目（31972564; 31972571; 31630072; 31601939）的資助。