白粉病是葫蘆科作物的三大主要病害之一。設(shè)施栽培中的高溫高濕環(huán)境很容易誘導(dǎo)白粉病的爆發(fā)，嚴(yán)重影響黃瓜產(chǎn)量和品質(zhì)。目前，黃瓜白粉病的防治主要依賴化學(xué)藥劑，然而在一個(gè)生長(zhǎng)季內(nèi)需多次施藥，對(duì)以鮮食為主的黃瓜而言，因農(nóng)藥殘留導(dǎo)致的食品安全隱患不容小覷。黃瓜白粉病抗性是由多基因位點(diǎn)控制的數(shù)量性狀，傳統(tǒng)育種技術(shù)很難高效整合多個(gè)抗病基因而不引入連鎖累贅。利用CRISPR/Cas多基因編輯技術(shù)同時(shí)敲除多個(gè)隱性抗病基因創(chuàng)制黃瓜白粉病抗性種質(zhì)，是黃瓜白粉病防治的新策略，具有重要的經(jīng)濟(jì)意義。

 

　　近日，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)別之龍教授/楊麗副教授團(tuán)隊(duì)在Plant Physiology在線發(fā)表了題為“Systemicanalysis of cucumber MLO family by multiplex gene editing for engineeringpowdery mildew resistance”的研究論文。在瓜類作物中首次建立高效的多基因編輯體系，利用該體系靶向敲除黃瓜CsMLO基因家族13個(gè)成員，成功獲得白粉病完全抗性黃瓜種質(zhì)材料，并通過多組學(xué)聯(lián)合分析解析了鈣信號(hào)參與Csmlo1/8/11介導(dǎo)的黃瓜白粉病抗性分子機(jī)制。

 

　　黃瓜白粉病抗性基因的研究最早可追溯到1940年代（He et al., 2013）。根據(jù)多年來研究人員對(duì)不同遺傳群體的黃瓜白粉病抗性基因定位研究，翁益群課題組總結(jié)歸納了19個(gè)共識(shí)性QTL位點(diǎn)（Wang etal., 2020）。然而，其中僅有pm5.3位點(diǎn)成功克隆到抗性基因，突顯了黃瓜白粉病抗性遺傳機(jī)制的復(fù)雜性。該基因Mildewresistance Locus o 8（CsMLO8）由蔡潤(rùn)和白玉玲課題同時(shí)報(bào)道（Berget al., 2015; Nie et al., 2015），在抗性材料中由于轉(zhuǎn)座子插入等原因，CsMLO8功能失活導(dǎo)致了隱性白粉病抗性。然而，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，盡管Csmlo8功能缺失突變?cè)谠S多黃瓜抗性種質(zhì)中普遍存在，但也觀察到部分種質(zhì)具有Csmlo8突變卻表現(xiàn)為白粉病易感的現(xiàn)象。這表明還存在其他抗病位點(diǎn)與Csmlo8共同介導(dǎo)白粉病抗性，黃瓜白粉病抗性的遺傳基礎(chǔ)仍然有待深入挖掘。CsMLO基因家族成員之間存在功能冗余性，前人的正向遺傳學(xué)研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)多個(gè)白粉病抗病QTL位點(diǎn)中存在CsMLO家族的其他基因，暗示了其他CsMLO成員與CsMLO8基因共同調(diào)控黃瓜白粉病抗性的可能性。因此，對(duì)CsMLO基因家族進(jìn)行系統(tǒng)功能分析將為黃瓜抗病分子育種提供理論基礎(chǔ)。

 

　　該研究首先采用II型啟動(dòng)子cestrum yellowleaf curling virus （CmYLCV） 驅(qū)動(dòng)由tRNAGly 間隔串聯(lián)的多個(gè)sgRNA，建立了一個(gè)高效的黃瓜多基因編輯系統(tǒng)。利用該系統(tǒng)，以易感白粉病的華南型黃瓜CU2種質(zhì)為受體，對(duì)CsMLO基因家族13個(gè)成員進(jìn)行了多基因編輯，獲得了一系列Csmlo單、多突變體。進(jìn)一步，對(duì)這些突變體的白粉病抗性和生長(zhǎng)表型進(jìn)行了系統(tǒng)調(diào)查。研究發(fā)現(xiàn)敲除CsMLO家族第V分支三個(gè)基因CsMLO1/8/11，所得單突變體Csmlo8仍然易感白粉病，所得雙突變體表現(xiàn)為中等白粉病抗性，尤其值得關(guān)注的是同時(shí)編輯這三個(gè)基因的黃瓜三突變體材料Csmlo1/8/11獲得了白粉病完全抗性。然而，并未觀察到五突變體Csmlo3/4/5/9/10白粉病抗性的改變。此外，對(duì)多個(gè)Csmlo突變體生長(zhǎng)表型進(jìn)行系統(tǒng)觀察還發(fā)現(xiàn)，相較于對(duì)照為五瓣花和三心室果實(shí)，Csmlo3/10突變體中黃瓜六瓣花、七瓣花的數(shù)目顯著增多，其四心室果實(shí)的比例也大幅提高。這是首次在植物中報(bào)道CsMLO家族Ⅱ分支成員的功能。而Csmlo12/13突變則導(dǎo)致雄性不育且葉面積增大的表型。因此，通過對(duì)CsMLO家族基因進(jìn)行多基因編輯，成功獲得了白粉病完全抗性黃瓜材料；對(duì)家族突變體白粉病抗性和生長(zhǎng)發(fā)育表型的系統(tǒng)調(diào)查，為利用Csmlo進(jìn)行黃瓜白粉病抗性育種提供了重要的理論依據(jù)。

 

　　研究人員進(jìn)一步基于所得不同抗病程度Csmlo突變體，采用高通量轉(zhuǎn)錄組與蛋白組關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)鈣信號(hào)在Csmlo1/8/11介導(dǎo)的白粉病抗性中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。在Csmlo1/8/11突變體中，鈣信號(hào)下游的三個(gè)基因CsKIC、CsCML28和CsCPK11的蛋白表達(dá)量顯著升高。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，CsKIC與第V分支成員CsMLO1/8/11均存在蛋白互作。通過VIGS瞬時(shí)沉默CsKIC，能增強(qiáng)黃瓜白粉病抗病性，這表明與CsMLO8的功能一致，CsKIC是白粉病抗性的負(fù)調(diào)控因子，猜測(cè)CsKIC與CsMLO1/8/11互作協(xié)同參與白粉病菌入侵過程。另外，通過VIGS瞬時(shí)沉默CsCML28和CsCPK11，觀察到黃瓜白粉病感病性增加；且二者分別與CsMLO1/8共沉默時(shí)，部分恢復(fù)了由于CsMLO1/8敲低而導(dǎo)致的白粉病抗性。這表明CsCML28和CsCPK11可能在CsMLO1/8的下游發(fā)揮正向調(diào)控作用，參與介導(dǎo)黃瓜白粉病抗性。最后，通過穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化得到了CsCPK11過表達(dá)植株，與對(duì)照相比，其白粉病抗性顯著增強(qiáng)。這些發(fā)現(xiàn)為深入理解Csmlo介導(dǎo)的黃瓜白粉病抗性機(jī)制提供了關(guān)鍵線索。

 

　　綜上所述，該研究為瓜類作物生物育種提供了高效的多基因編輯工具，為黃瓜白粉病抗性育種提供了寶貴的基因和種質(zhì)資源。該研究深入解析鈣信號(hào)參與Csmlo1/8/11介導(dǎo)的白粉病抗性分子機(jī)制，也為豐富白粉病抗病調(diào)控模型提供了新的理論依據(jù)。

 

　　華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝林學(xué)學(xué)院別之龍教授和楊麗副教授為本文共同通訊作者，在讀博士生馬明茹和楊麗副教授為第一作者。西北農(nóng)林科技大學(xué)李大偉副教授和華中農(nóng)業(yè)大學(xué)孔秋生教授參與了本項(xiàng)研究。本研究得到國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國(guó)家自然科學(xué)基金、湖北省自然科學(xué)基金創(chuàng)新群體和湖北省重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目等課題資助。