深圳先進(jìn)院實現(xiàn)植物激素茉莉素在釀酒酵母的異源從頭合成

　　11月14日，中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院合成生物學(xué)研究所研究員羅小舟和教授Jay. D. Keasling課題組，在《自然-合成》（Nature Synthesis）上，發(fā)表了題為Engineering yeast for de novo synthesis of jasmonates的研究文章。該研究針對現(xiàn)階段植物激素茉莉素在生產(chǎn)上面臨的化學(xué)合成難度大、植物提取得率低等挑戰(zhàn)，提出在釀酒酵母中重構(gòu)茉莉素的生物合成途徑，建立微生物細(xì)胞工廠以實現(xiàn)高效和綠色生產(chǎn)，為茉莉素在農(nóng)業(yè)等方面的規(guī)?；瘧?yīng)用鋪平道路。

 

　　茉莉素（jasmonates）是茉莉酸及其衍生物茉莉酸甲酯、茉莉酸異亮氨酸等的統(tǒng)稱。作為植物的抗性激素，茉莉素在調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育和逆境應(yīng)答過程中具有重要作用，被廣泛應(yīng)用于增產(chǎn)提質(zhì)、抗寒防凍、抵御蟲害等。然而，茉莉素主要來源于傳統(tǒng)的植物提取，但植物中的低含量與萃取過程的繁瑣在不同程度上導(dǎo)致生產(chǎn)成本攀升；復(fù)雜的立體構(gòu)型，給化學(xué)全合成帶來挑戰(zhàn)，生產(chǎn)上的困境限制了茉莉素的規(guī)模化應(yīng)用。

 

　　自1962年從素馨花中首次發(fā)現(xiàn)并分離茉莉酸甲酯以來，科學(xué)家致力于茉莉素生物合成通路的解析，完整的合成途徑于2012年問世。茉莉素在植物中的合成過程較為復(fù)雜、通路長、酶促類型多樣，并涉及中間產(chǎn)物在不同細(xì)胞器間的轉(zhuǎn)運(yùn)【磷脂酶先將α-亞麻酸（α-LeA）從葉綠體膜上釋放；α-LeA在葉綠體內(nèi)，由多酶復(fù)合體催化形成12-氧代-植物二烯酸（OPDA）；OPDA在過氧化物酶體中，經(jīng)過3輪β-氧化生成茉莉酸（JA）；JA在細(xì)胞質(zhì)中被轉(zhuǎn)化為下游衍生物茉莉酸甲酯（MeJA）、茉莉酸異亮氨酸（JA-Ile）等】。一般認(rèn)為的安全的釀酒酵母因含有多種細(xì)胞器，被該團(tuán)隊優(yōu)先選擇為茉莉素異源從頭合成的微生物底盤。合成途徑的復(fù)雜度為重構(gòu)工作帶來了挑戰(zhàn)。其中，在酵母中找尋適合中間體α-LeA和OPDA合成的場所，是途徑重構(gòu)首要解決的難題。

 

　　該研究在酵母的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成α-LeA。α-LeA在植物的葉綠體中被合成，而酵母缺少葉綠體結(jié)構(gòu)；酵母雖不能從頭合成α-LeA，卻可以在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成α-LeA的前體。受到上述研究的啟發(fā)，該團(tuán)隊嘗試在酵母的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成α-LeA。研究通過在釀酒酵母中引入克魯維酵母來源的FAD，實現(xiàn)了α-LeA在酵母的從頭合成，但α-LeA的產(chǎn)量僅0.7 mg/L，遠(yuǎn)不夠進(jìn)行下游轉(zhuǎn)化。共聚焦實驗表明，相關(guān)基因均成功定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。同時，研究基于改造自由脂肪酸的代謝通路，將α-LeA的產(chǎn)量提升至51.2 mg/L。

 

　　進(jìn)一步，該團(tuán)隊在酵母的細(xì)胞質(zhì)中合成OPDA。OPDA在植物的葉綠體中被合成，同樣需要在酵母中尋找適合OPDA合成的場所。細(xì)胞質(zhì)和過氧化物酶體是潛在的候選選項：若在細(xì)胞質(zhì)中合成OPDA，后續(xù)需要OPDA轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)過氧化物酶體完成下游轉(zhuǎn)化；若在過氧化物酶體中合成OPDA，則需要底物α-LeA先行轉(zhuǎn)運(yùn)至過氧化物酶體?？紤]到α-LeA在過氧化物酶體中被降解的可能性，該團(tuán)隊嘗試將OPDA合成途徑（LOX、AOS和AOC）定位至酵母的細(xì)胞質(zhì)中。該團(tuán)隊對不同來源的LOX進(jìn)行活性篩選和組合表達(dá)，將中間體13-HPOT的產(chǎn)量提升至10.8 mg/L。該研究繼續(xù)引入AOS和AOC，實現(xiàn)OPDA的生產(chǎn)，產(chǎn)量達(dá)4.9 mg/L。共聚焦實驗表明，相關(guān)基因均成功定位在酵母的細(xì)胞質(zhì)。

 

　　該研究在酵母的過氧化物酶體中合成JA。鑒于植物和酵母在β-氧化過程上的相似性，該研究直接模仿植物中JA的合成過程，在酵母中引入保留了自身過氧化物酶體定位肽的相關(guān)酶（OPR、ACS、ACX、MFP和KAT），在過氧化物酶體中實現(xiàn)JA的合成，產(chǎn)量達(dá)9.6 mg/L；進(jìn)一步飼喂底物α-LeA，JA的產(chǎn)量可達(dá)19.0 mg/L。

 

　　該團(tuán)隊在酵母的細(xì)胞質(zhì)中合成MeJA和JA-Ile等衍生物。研究人員在產(chǎn)JA的酵母底盤中引入JMT以合成MeJA，產(chǎn)量達(dá)3.1 mg/L；引入JAR合成JA-Ile，產(chǎn)量達(dá)7.0 mg/L。

 

　　上述研究建立了植物激素茉莉素的酵母細(xì)胞工廠。相較于傳統(tǒng)的植物提取，此法在生產(chǎn)上不受時令限制、可規(guī)模化放大，為茉莉素的高效和綠色生產(chǎn)提供了重要參考。

 

　　研究工作得到國家重點研發(fā)計劃、國家自然科學(xué)基金、廣東省基礎(chǔ)與應(yīng)用基礎(chǔ)研究基金、深圳市科技計劃和深圳合成生物學(xué)創(chuàng)新研究院等的支持。