2023年1月，華南農業(yè)大學獸醫(yī)學院黃耀偉教授課題組以華南農業(yè)大學獸醫(yī)學院/嶺南現(xiàn)代農業(yè)廣東省實驗室為第一單位，在國際病毒學權威雜志Journal of Virology在線發(fā)表題為“Chicken or porcine aminopeptidase N mediates cellular entry of pseudoviruses carrying spike glycoprotein from the avian deltacoronaviruses HKU11, HKU13, and HKU17”的文章（鏈接：https://journals.asm.org/doi/10.1128/jvi.01947-22），首次報道表達三種代表性野禽丁型冠狀病毒（Deltacoronavirus, DCoV）——HKU11, HKU13或HKU17 的刺突蛋白（Spike）的假病毒可分別通過雞或豬氨基肽酶N（APN）介導入侵相應種屬的細胞，揭示自然界種類繁多的野禽DCoVs具備潛在的野禽到家禽、以及鳥類到哺乳類的跨物種傳播能力。
依據國際病毒分類委員會（ICTV）的分類，目前冠狀病毒科成員分為Alphacoronavirus, Betacoronavirus, Gammacoronavirus, Deltacoronavirus四個屬，其中DCoV又分為Andecovirus, Buldecovirus, Herdecovirus三個亞屬并包含七個種。DCoV主要感染約30個科，108個屬的不同種類野禽，具有廣泛的演化多樣性和復雜的宿主生態(tài)學特征，但極少受到研究人員關注。鑒定宿主受體是研究冠狀病毒入侵細胞與跨種傳播機制的關鍵。目前沒有一種野禽DCoV被分離培養(yǎng)出來，對其入侵細胞受體也不清楚。
在DCoV的Buldecovirus亞屬中，豬丁型冠狀病毒（porcine deltacoronavirus，PDCoV，或稱HKU15）是唯一一種感染哺乳類的成員，屬于新發(fā)豬腸道冠狀病毒的一種，近年來已在中國、東南亞、北美洲等區(qū)域引發(fā)豬場新生仔豬腹瀉疫情，造成養(yǎng)豬業(yè)經濟損失。新冠疫情爆發(fā)以來，在海地的三名發(fā)熱兒童中檢測到PDCoV核酸，其序列分別屬于北美譜系與中國譜系，表明PDCoV可能已經從動物外溢至人類。
自2013年起，黃耀偉課題組一直致力于幾種新發(fā)與再現(xiàn)豬腸道冠狀病毒，包括PDCoV的基礎研究。在2018年率先報道豬APN為PDCoV的主要入侵細胞受體（Journal of Virology, 2018, 92:e00318-18）；進一步鑒定出其它四個不同種屬（人、小鼠、貓、雞）APN也可以介導PDCoV進入細胞，并且另一種宿主因子唾液酸參與PDCoV刺突蛋白S1亞基的受體結合與病毒中和作用（Journal of Virology, 2021, 95:e01118-21）。受以上結果啟發(fā)，課題組進一步猜想可能會有特定種類的野禽DCoVs（如Buldecovirus亞屬成員）也利用APN入侵細胞。
本研究首先分析了DCoV Andecovirus, Buldecovirus, Herdecovirus三個亞屬成員的S和S1 氨基酸序列，系統(tǒng)演化構建結果顯示Buldecovirus亞屬分為迥異的兩組（G1及G2），其中夜鶯DCoV HKU11、文鳥DCoV HKU13、美國麻雀DCoV ISU42824與PDCoV同屬于G1；而G2包括中國麻雀DCoV HKU17、中東的獵鷹DCoV HKU27、鴇DCoV HKU28與鴿子DCoV HKU29。G1組的分型與基于復制酶RdRp的Buldecovirus分型一致，但G2組則更接近Herdecovirus亞屬（圖A和圖B）。因此，Buldecovirus G2組成員很可能是在病毒演化過程中來自于G1組（提供全長基因組骨架）與Herdecovirus亞屬（提供并取代了G1的S基因）的重組產物，從而兩種在中國香港和美國分別鑒定的麻雀DCoV有不同的進化路徑。與之相應，同源建模分析HKU11和HKU13的RBM結構更接近已知的PDCoV，而HKU17的RBM則與PDCoV有較大區(qū)別。
進一步的免疫共沉淀實驗顯示，HKU11、HKU13、HKU17的S1與雞APN（chAPN）或豬pAPN（pAPN）可以相互作用；流式細胞分析顯示，以上的S1純化蛋白可以在細胞表面結合穩(wěn)定表達chAPN 或pAPN的PDCoV非易感細胞，以及結合內源表達chAPN 或pAPN的雞細胞或豬細胞。制備攜帶這些DCoV S蛋白（包括來自ISU42824的S）的假型慢病毒可以分別感染穩(wěn)定表達chAPN 或pAPN的非易感細胞與內源表達chAPN 或pAPN的雞細胞或豬細胞。而敲除chAPN 或pAPN后，這些假病毒對相應的敲除雞細胞系或豬細胞系的入侵水平顯著下降或幾乎消失（圖C,和圖D）。最后，與此前報道的PDCoV感染細胞結果類似（Emerging Microbes & Infections, 2020, 9:457-468），加入胰酶可以顯著促進這些假病毒入侵豬腸道上皮細胞（圖E）。以上結果表明，夜鶯 HKU11、文鳥HKU13、以及兩種麻雀DCoV（來自美國的ISU42824與來自中國香港的HKU17），均有可能利用chAPN 或pAPN作為受體入侵細胞，盡管HKU17的S蛋白在進化上與PDCoV及ISU42824有較大差異。
本研究對此前極少關注的野禽丁型冠狀病毒病原生態(tài)學及跨種傳播潛力進行了分析，首次揭示了不同DCoVs在其野禽宿主之間交叉?zhèn)鞑サ墓餐肿踊A。同時，這也是課題組過去幾年持續(xù)對PDCoV入侵細胞和跨種傳播分子機制進行原創(chuàng)研究的延續(xù)。鑒于野禽DCoVs的多樣性（可能不亞于蝙蝠類CoVs），以及已有PDCoV跨種傳播的先例（據分子鐘分析推測，PDCoV與麻雀DCoV ISU42824成員同源，大約在上世紀九十年代初從麻雀跳躍到豬，并最后外溢至人類），這一大類冠狀病毒將來是否從各自的野禽宿主，繼續(xù)外溢至家禽和哺乳類，值得關注和進一步監(jiān)測。
黃耀偉教授為論文通訊作者。本研究受廣東省嶺南實驗室科研項目（NG2022001）、國家自然科學基金-廣東省區(qū)域創(chuàng)新聯(lián)合基金重點項目（U22A20521） 及浙江省自然科學基金重點項目（LZ22C180002）資助。研究工作得到了獸醫(yī)學院馮耀宇教授、哈爾濱獸醫(yī)研究所湯艷東研究員的大力支持和協(xié)助。
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